慢性丙型肝炎患者microRNA122水平與肝組織炎癥壞死程度的關(guān)系

程文婷 孔德華

慢性丙型肝炎(CHC)是我國患病率較高的一種肝臟疾病，主要因HCV感染所致。研究表明在急性感染者中，約55%～85%的患者進(jìn)展成慢性，而慢性丙型肝炎危害性非常大，若未能及時(shí)治療，則可進(jìn)展為肝細(xì)胞性肝癌、肝硬化，對患者生命構(gòu)成威脅[1]。研究發(fā)現(xiàn)多種炎癥細(xì)胞因子參與了CHC進(jìn)展過程，如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)等，炎癥因子釋放增加會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，引起肝臟損害[2]。近年來，研究指出microRNAs參與了肝病病理過程，它對細(xì)胞凋亡、增殖有調(diào)節(jié)作用，而MicroRNA-122是肝臟特異性RNA，對維持肝臟功能運(yùn)行有重要意義[3]。本次研究為了進(jìn)一步了解CHC的病理特征，納入100例患者為研究對象，分析CHC患者microRNA122水平與肝組織炎癥壞死程度的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合慢性丙型肝炎抗病毒治療專家委員會提出的《慢性丙型肝炎抗病毒治療專家共識》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，臨床診斷明確；(2)年齡≥18歲；(3)入院前3個(gè)月內(nèi)無抗病毒、免疫抑制治療史；(4)臨床病例資料完整；(5)精神狀態(tài)、認(rèn)知正常；(6)知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎、肺、心、腦等重要器官損害；(2)癌癥病史；(3)肝臟衰竭；(4)合并肝脂肪變、肝血管瘤等其他肝病；(5)慢性乙型肝炎、甲型肝炎。

二、一般資料

納入我院2014年3月～2017年3月收治的CHC患者100例作為病例組，選取同期于我院體檢的100例體檢者作為對照組。病例組男56例，女44例，年齡23～75歲，平均(49.42±10.83)歲；體質(zhì)指數(shù)18～26 kg/m2，平均(22.53±2.06)kg/m2；HCV基因型：1型84例，2/3型12例，6型4例；感染途徑：輸血感染26例，性傳播感染49例，吸毒感染18例，不明原因7例。對照組男53例，女47例，年齡20～78歲，平均(51.69±12.32)歲；體質(zhì)指數(shù)18～26 kg/m2，平均(22.34±2.11)kg/m2。兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

三、檢測方法

兩組受檢者均于入院當(dāng)日留取5 mL血清樣本，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定microRNA122在血清中的表達(dá)水平：(1)組織制片染色：石蠟包埋制片→切片→脫蠟→HE染色→Masson染色。①HE染色過程：切片、脫蠟、蒸餾水，蘇木素染色(約5～10 min)，利用水沖洗2次，伊紅染色3 min，利用水沖洗2次，經(jīng)數(shù)脂封片、固定。②Masson染色：切片、脫蠟、蒸餾水，蘇木素染色(約5～10 min)，流水藍(lán)化，水洗，酸性品紅液中染(6～8 min)，水洗，經(jīng)濃度為1%的磷鉬酸中染(2～3 min)，加苯胺藍(lán)液，反應(yīng)5 min，沖洗，烘干，樹脂封片、固定。(2)提取血清microRNA：①取200 μL樣本，加變性溶液混勻；②取氯仿300 μL混勻；③離心5 min，分離血清；④加無水乙醇混勻；⑤棄廢液；⑥加Wash Solution，離心15 s；⑦棄廢液；⑧重復(fù)上述步驟，空甩離心柱；⑨加DEPC水，離心30 s；⑩定量檢測RNA。(3)PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，(95 ℃ 15 s、60 ℃ 4 min，12個(gè)循環(huán))，99.9 ℃，10 min。

四、觀察指標(biāo)

比較病例組、對照組患者microRNA122在血清中的表達(dá)水平，并按照肝組織炎癥活動度分級標(biāo)準(zhǔn)(G)對病例組患者進(jìn)行炎癥程度分級，以≤G2級為輕度炎癥組，>G2級為中重度炎癥組，比較兩組血清microRNA122表達(dá)水平。炎癥程度分級標(biāo)準(zhǔn)[5]：采用G0～G4等級進(jìn)行評估，無炎癥活動為G0級，肝門區(qū)可見輕度炎癥為G1級，輕微碎屑樣壞死為G2級，中度碎屑樣壞死為G3級，重度碎屑樣壞死為G4級，分別賦0、1、2、3、4分，分值越高表明炎癥壞死程度越重。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、病例組、對照組的血清microRNA122表達(dá)水平比較

病例組血清microRNA122表達(dá)水平為(4.728～5.525)lg 拷貝數(shù)/μL，平均(5.153±0.213)lg 拷貝數(shù)/μL。對照組為(3.723～4.316)lg 拷貝數(shù)/μL，平均(4.009±0.242)lg 拷貝數(shù)/μL。病例組血清microRNA122表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.485，P=0.000)。

二、輕度炎癥組、中重度炎癥組的血清microRNA122表達(dá)水平比較

通過對患者的肝組織炎癥壞死程度進(jìn)行分級，提示輕度炎癥組48例(48.00%)，中重度炎癥組52例(52.00%)。輕度炎癥組血清microRNA122表達(dá)水平為(4.728～5.164)lg 拷貝數(shù)/μL，平均(4.893±0.021)lg 拷貝數(shù)/μL。中重度炎癥組為(5.156～5.525)lg 拷貝數(shù)/μL，平均(5.242±0.032)lg 拷貝數(shù)/μL。輕度炎癥組的血清microRNA122表達(dá)水平低于中重度炎癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=91.181，P=0.000)。

三、血清microRNA122對CHC中重度炎癥壞死的預(yù)測價(jià)值分析

血清microRNA122表達(dá)水平預(yù)測CHC中重度炎癥壞死的曲線下面積為0.662(標(biāo)準(zhǔn)誤=0.054，P=0.005，95%CI=0.556～0.768)，最佳截?cái)嘀禐?.920 lg 拷貝數(shù)/μL，敏感度為0.596，特異度為0.646，ROC曲線圖見圖1。

圖1 血清microRNA122預(yù)測CHC中重度炎癥壞死的ROC曲線圖

四、CHC患者血清microRNA122表達(dá)與肝組織炎癥壞死評分的相關(guān)性

CHC患者肝組織炎癥壞死評分為(2.74±1.25)分，血清microRNA122表達(dá)水平為(5.153±0.213)lg 拷貝數(shù)/μL。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析提示，血清microRNA122表達(dá)水平與肝組織炎癥壞死評分呈正相關(guān)(r=0.571，P=0.000)，二者線性相關(guān)圖見圖2。

圖2 CHC患者血清microRNA122表達(dá)與肝組織炎癥壞死評分線性相關(guān)圖

討 論

我國HCV感染率非常高，約50%的患者經(jīng)治療后，預(yù)后良好，但仍有部分病例效果欠佳，其抗病毒治療療效可能與免疫病、肝纖維化、胰島素抵抗、肥胖等因素相關(guān)[6]。近年來，有研究指出microRNA122對肝臟特異性微小RNA存在調(diào)節(jié)作用，miR-122內(nèi)含核苷酸總數(shù)為85個(gè)，當(dāng)其被滅活后，HCV復(fù)制能力下降，提示miR-122對HCV復(fù)制有促進(jìn)作用[7]。另有研究證實(shí)microRNA-122與HCV復(fù)制呈正相關(guān)[8]。然而，既往研究中主要集中于分析microRNA-122與HCV復(fù)制的關(guān)系，缺乏對microRNA-122與肝組織炎癥關(guān)系的探討。肝臟炎癥壞死程度是反映患者病情的重要指標(biāo)，及時(shí)了解患者機(jī)體炎癥情況，有利于進(jìn)一步評估其疾病嚴(yán)重度，為疾病治療提供依據(jù)。

本次研究著重于分析microRNA-122與CHC患者肝組織炎癥壞死程度的關(guān)系，結(jié)果顯示與體檢者相比，CHC患者的血清microRNA122表達(dá)水平顯著增高，提示這類患者病情進(jìn)展可能與microRNA122在血清內(nèi)的表達(dá)水平相關(guān)。研究表明與血清ALT相比，microRNA122對急性肝損傷的評估價(jià)值更高，能有效評價(jià)肝臟損害程度，即便患者血清ALT在正常范圍，其microRNA122在血清中的表達(dá)明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)血清microRNA122表達(dá)量對肝臟損害具有較高診斷價(jià)值[9]，為本研究開展提供了理論依據(jù)。

CHC進(jìn)展過程與機(jī)體炎癥存在密不可分的關(guān)系，當(dāng)發(fā)生HCV感染后，可導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡，即Th1/Th2失衡，不利于清除HCV，且會抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而致使患者機(jī)體處于持續(xù)感染狀態(tài)，進(jìn)一步損害肝細(xì)胞功能。本研究根據(jù)CHC患者肝組織炎癥壞死程度將其分為輕度炎癥組、中重度炎癥組，結(jié)果提示中重度炎癥組的血清microRNA122表達(dá)水平高于輕度炎癥組，提示血清microRNA122表達(dá)量增高可能與炎癥程度相關(guān)。研究表明當(dāng)出現(xiàn)藥物性肝損傷、病毒性肝炎等肝損害時(shí)，microRNA122在外周血中的表達(dá)水平增高，且隨著炎癥程度加深，其表達(dá)量越高[10]，與本研究結(jié)論基本符合。本研究通過繪制ROC曲線，證實(shí)血清microRNA122表達(dá)水平對CHC患者肝組織炎癥壞死程度具有一定預(yù)測價(jià)值，且血清microRNA122表達(dá)與肝組織炎癥壞死評分呈正相關(guān)，這可能的原因在于microRNA122參與了脂肪酸氧化反應(yīng)過程，從而促進(jìn)炎癥進(jìn)展。

綜上，本研究證實(shí)與體檢者相比，CHC患者的血清microRNA122表達(dá)水平增高，且血清microRNA122表達(dá)量與肝組織炎癥壞死程度呈正相關(guān)，研究的創(chuàng)新之處在于明確了輕度炎癥、中重度炎癥的最佳截?cái)嘀?，能為臨床治療提供依據(jù)。此外，本次研究因受病例研究經(jīng)費(fèi)、研究時(shí)間等因素限制，導(dǎo)致納入樣本量少，未來還需擴(kuò)大樣本量，對此進(jìn)行多中心、大樣本量的探討。