肝組織切片不同保存時間抗原丟失比較

陳高峰 馬園園 陶艷艷

臨床與實驗研究中，研究人員習慣將組織切片保存在室溫條件下，有研究初步發(fā)現(xiàn)，組織切片室溫保存6個月部分抗體檢測不出陽性結(jié)果，這提示組織切片室溫下保存可能導致抗原丟失[1]。但是組織切片室溫保存不同時間抗原是否丟失？不同部位抗原丟失是否一致？組織切片蠟封后是否能減少抗原丟失？針對上述問題，我們采用纖維化肝組織蠟塊連續(xù)切片，室溫條件下放置0、24、48與96周時浸蠟封片，免疫組化染色觀察細胞膜、細胞漿、細胞核三個不同部位抗原表達變化，用于指導臨床與實驗研究中組織切片保存。

資料與方法

一、實驗動物

Fisher344 18只，雄性，SPF級，體質(zhì)量160～180 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，設(shè)施許可證號：SYXK(滬)2009-0069。所有動物均自由飲食飲水。

二、主要試劑

四氯化碳(CCl4)，化學純，批號20140325；橄欖油，化學純，批號F20140402，購自國藥集團；二乙酰氨基芴(2-Acetamidofluorene，2-AAF)，Lot#：SLBJ2755V，購自sigma；天狼猩紅試劑，貨號G1470購自Solarbio；HE試劑，貨號D005-1，購自南京建成；免疫組化Ⅰ抗：CK7，貨號ab181598；Hedgehog信號通路配體蛋白(sonic hedgehog，SHH)，貨號ab73958；肝細胞標志物(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF 4α)，貨號ab216897。Ⅱ抗：小鼠與兔HRP/DAB (ABC)檢測試劑盒，貨號ab64264，均購自abcam公司。

三、研究方法

(一)模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用30% CCl4/橄欖油溶液2 mL·kg-1皮下注射，每周2次，共計6周；第7周開始，模型繼續(xù)30% CCl4皮下注射的同時添加10 mg·kg-1·d-12-AAF灌胃3周，共9周，建立2-AAF/ CCl4大鼠肝纖維化模型。

(二)樣品的采集和處理 造模9周結(jié)束，2%戊巴比妥鈉2 mL·kg-1腹腔注射麻醉，仰臥位固定，打開腹腔。經(jīng)下腔靜脈采血后從肝右葉切取1.5 cm × 1.0 cm × 0.5 cm大小肝組織1塊，10%甲醛溶液固定，脫水、包埋，用于HE、膠原及免疫組化染色。

(三)肝組織石蠟切片保存 每例肝組織石蠟塊連續(xù)切片12張，分成3組(分別用于HE、天狼猩紅膠原與免疫組化染色)，每組4張(用于設(shè)0、24、48、96周共4個不同時間點)。切片于常溫空氣中放置0、24、48、96周時浸蠟封片；96周時切片統(tǒng)一脫蠟至水進行HE染色、天狼猩紅膠原染色及免疫組化染色(細胞膜蛋白膽管上皮細胞標志物CK7、細胞漿蛋白SHH，細胞核蛋白肝細胞標志物HNF 4α)，觀察肝組織炎癥、膠原沉積與不同部位組織細胞抗原表達變化。

(四)肝組織HE與天狼星紅膠原染色 肝組織經(jīng)中性甲醛緩沖液固定，石蠟包埋。HE染色：石蠟切片，切片為4 μm厚度，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水水洗3～5 min，Harris蘇木素液染 15 min，自來水洗3～5 min，5%鹽酸酒精分化10 s，水洗藍化 3～5 min，鏡檢細胞核，伊紅復染10 s，梯度脫水，二甲苯透明，封片。天狼猩紅膠原染色：石蠟切片，切片為4 μm厚度，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水水洗3～5 min，天狼星紅染色液滴染15 min，無水乙醇分化，二甲苯透明，封片。膠原染色陽性面積分析：采用OlympusDP71顯微數(shù)碼CCD采集圖片，用Image-Pro Plus 6.1進行肝組織膠原面積半定量分析。

(五)肝組織免疫組化染色 肝組織石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3次各5 min，新鮮配制的3%H2O2，37 ℃封閉10 min，PBS洗3次各5 min；抗原修復(微波檸檬酸修復)把切片放入置有檸檬酸的緩沖液中100 ℃ 10 min，自然冷卻；PBS洗3次各5 min；滴加5% BSA封閉液，37 ℃ 10 min，甩去多余液體；滴加一抗50 μL，4 ℃過夜；PBS洗3次各5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃ 30 min；PBS洗3次各5 min；滴加試劑SABC 37 ℃ 10 min；PBS洗3次各5 min；DAB顯色，蘇木素染核，脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化染色陽性面積分析：采用OlympusDP71顯微數(shù)碼CCD采集圖片，用Image-Pro Plus6.1進行肝組織陽性表達面積半定量分析。

四、統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0進行統(tǒng)計分析，計量資料用表示，符合正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)用配對t檢驗，不符合正態(tài)性或方差齊性的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗。

結(jié) 果

一、肝組織細胞膜、細胞漿與細胞核抗原表達變化

免疫組化染色結(jié)果顯示，CK7蛋白表達于膽管上皮細胞，應(yīng)用ImagePro Plus軟件半定量分析顯示，0周時CK7陽染面積為12.70%±0.90%；24周時顯著減少至9.02%±0.61%，為0周的71.02%(P<0. 05)；48周時顯著減少至5.97%±0.57%，為0周的47.01%(P<0. 05)；96周時顯著減少至4.28%±0.61%，為0周陽染面積的33.70%(P<0.05)；見圖1、表1。

SHH蛋白抗原表達于肝細胞漿，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.1軟件半定量分析顯示，0周SHH陽染面積為45.44%±6.11%；24周時顯著減少至22.44%±2.45%，為0周的49.38%(P<0.05)；48周時顯著減少至11.96%±1.24%，為0周的26.32%(P<0.05)；96周時顯著減少至9.44%±1.07%，為0周SHH陽染面積的20.77%(P<0.05)；見圖2、表1。

HNF-4ɑ蛋白抗原表達于肝細胞核。應(yīng)用ImagePro Plus 6.1軟件半定量分析顯示， 0周HNF-4ɑ陽染面積占9.38%±0.62%；24周時顯著減少至4.48%±0.55%，為0w點的47.76%(P<0.05)；48周時顯著減少至1.36%±0.33%，為0周的14.50%(P<0.05)；96周時顯著減少至1.07%±0.06%，為0周HNF-4ɑ陽染面積的11.41%(P<0.05)；見圖3、圖4。

注：A：0周；B：24周；C：48周；D：96周

圖1肝組織切片室溫不同放置時間CK7免疫組化染色、HE染色與天狼猩紅膠原染色變化(×200)

注：A：0周；B：24周；C：48周；D：96周

圖2肝組織切片室溫不同放置時間SHH免疫組化染色、HE染色與天狼猩紅膠原染色變化(×200)

二、肝組織炎癥和膠原沉積變化

HE染色結(jié)果顯示，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，小葉內(nèi)肝細胞疏松，散在的少量點狀壞死，匯管區(qū)大量炎癥伴中度界面炎，偶見漿細胞浸潤，纖維組織增生，纖維間隔形成。HE染色顯示，0～96周不同時間點肝組織炎癥病理無明顯改變。見圖1、2、3。

天狼猩紅染色結(jié)果顯示，模型大鼠肝臟膠原纖維增生明顯，大量纖維間隔向小葉內(nèi)延伸，可見匯管區(qū)間(P-P)纖維間隔和匯管區(qū)-中央靜脈(P-C)纖維間隔形成，部分有明顯的纖維間隔和再生結(jié)節(jié)。應(yīng)用ImagePro Plus軟件半定量分析顯示，與0周相比，肝組織切片室溫放置24、48、96周不同時間，CK7染色組、SHH染色組與HNF-4ɑ染色組膠原面積率均逐漸減少，96周膠原面積顯著減少至0周的73.76%、74.44%與64.54%。見圖1～3與表1。

注：A：0周；B：24周；C：48周；D：96周

圖3肝組織切片室溫不同放置時間HNF-4ɑ免疫組化染色、HE染色與天狼猩紅膠原染色變化(×200)

討 論

免疫組化是應(yīng)用免疫學抗原抗體反應(yīng)的基本原理，對組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))進行定位、定性及定量的研究方法[2]。隨著免疫組化技術(shù)在病理診斷/療效判斷、基礎(chǔ)醫(yī)學研究中的廣泛應(yīng)用，其結(jié)果的可靠性、重現(xiàn)性愈來愈受到重視。組織固定、切片保存、染色前處理及染色中的實驗操作，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能直接影響免疫組化染色，從而影響診斷或科研結(jié)果的準確性。因此許多專家提出重視免疫組化的質(zhì)量控制和標準化，包括組織取材和固定、石蠟切片保存時間、方法和溫度、組織封閉和抗原修復等質(zhì)量控制[3-4]。

組織切片存儲于室溫條件下是否抗原會丟失？這一直是困擾著我們的一個問題。本研究中，組織切片分別于室溫條件下放置0、24、48、96周時浸蠟封存，96周時統(tǒng)一脫蠟至水后開展HE、天狼猩紅及免疫組化染色。隨著組織切片放置時間延長至96周，膠原面積顯著減少至0周的64.54～74.44%；隨著時間延長，CK7陽染面積從0周12.70%下降至96周時的4.28%，僅占0周的33.70%； SHH陽染面積從0周45.44%下降至96周時的9.44%，僅占0周SHH的20.77%%；與0周相比，96周點細胞核抗原HNF 4ɑ僅微弱表達，僅為0周的11.41%。上述結(jié)果提示，隨著切片室溫放置時間延長至96周時，膠原面積約為0周時點的70%；組織細胞抗原在24周時已經(jīng)出現(xiàn)明顯丟失，至96周損失更為嚴重，尤其核抗原丟失更為突出，究其原因可能與空氣中氧化作用有關(guān)。

表1 肝組織細胞抗原陽染率與膠原面積率變化(%)

注：與0周相比，#P<0.05,##P<0.01

本研究中切片室溫放置時間延長，膠原與抗原表達均逐漸減少，但抗原丟失更為突出。膠原是細胞外基質(zhì)主要蛋白質(zhì)成分，纖維膠原的分子結(jié)構(gòu)特征是由3條左手螺旋α肽鏈絞合成右手旋轉(zhuǎn)的超三螺旋，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[5]，這也可能是膠原丟失沒有組織細胞抗原損失明顯的原因。有研究者提出[6]，若要長期保存組織切片等生物樣本應(yīng)放入-20℃及以下低溫保存，但低溫條件會受到場地設(shè)備等條件限制；本研究采用纖維化肝組織連續(xù)切片，分別于室溫條件下放置0～96周時石蠟封固切片，結(jié)果提示組織切片石蠟封固可以避免抗原損失。所以在實際工作中可以采用來避免抗原損失以便長期保存，這就可以大大降低抗原丟失率，用于指導臨床與實驗研究中組織切片保存。