紅景天苷對力竭大鼠心肌細胞凋亡通路的影響*

郄 濤， 徐 鵬， 張丙信， 曹雪濱△

(1. 保定市第一中心醫(yī)院急診科， 河北 保定 071000； 2. 陸軍第82集團軍醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 保定 071000；3. 保定市第一中心醫(yī)院病理科， 河北 保定 071000)

運動是機體的一種外在刺激, 運動強度不同會對心臟產(chǎn)生不同影響。適宜運動對心臟有益，高強度運動如力竭性運動，超出人或動物生理極限，則導(dǎo)致心臟損傷。在當(dāng)今軍隊高強度實戰(zhàn)化訓(xùn)練和體育競技中，如何進行科學(xué)的運動訓(xùn)練，減少運動和訓(xùn)練所致的心肌損傷，提高成績是軍事訓(xùn)練和體育運動中需關(guān)注的課題。

力竭運動是疲勞運動的一種特殊形式，是在疲勞時繼續(xù)運動，直到肌肉和器官不能維持運動的狀態(tài)[1]。力竭運動造成心肌損傷，課題組前期實驗也證實力竭運動可造成心臟超微結(jié)構(gòu)破壞，心功能減低及心電改變，能量代謝障礙、線粒體功能異常[2-4]。力竭運動時體內(nèi)代謝率增加，心肌需氧量增加，導(dǎo)致心肌缺血缺氧。趙敬國發(fā)現(xiàn)大鼠心電圖在力竭運動后出現(xiàn)心肌缺血導(dǎo)致ST-T變化。心肌缺血缺氧是力竭運動所致心臟損傷的始動因素。力竭運動能上調(diào)心肌絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中p38磷酸化水平，其與細胞凋亡密切相關(guān)的[5]。Carraro等的研究顯示，力竭運動及過度訓(xùn)練可致心肌細胞凋亡數(shù)量顯著增加。因此凋亡亦是造成力竭運動心臟損傷的原因之一。目前認為細胞凋亡主要通過細胞外死亡受體和細胞內(nèi)線粒體介導(dǎo)的兩條途徑實現(xiàn)。因此，本試驗觀察本方案力竭運動凋亡情況及對上述凋亡途徑的影響。

紅景天苷(salidroside, Sal)由植物紅景天中高效萃取所得，其具有力竭心臟保護作用，可有效減少力竭所致的心肌結(jié)構(gòu)損傷，改善心肌缺血，并改善心肌線粒體能量代謝[2]。紅景天苷可抑制缺血/再灌注損傷、急性心肌缺血缺氧等多種因素誘導(dǎo)的細胞凋亡[6, 7]。因此，本實驗觀察紅景天苷能否通過減少心肌缺血，調(diào)控心肌細胞死亡受體和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)蛋白來改善力竭運動所致心肌細胞凋亡，發(fā)揮對力竭心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

MutiscanGO 酶標(biāo)儀，SIGMA 3K15高速冷凍離心機。99%紅景天苷粉劑(Lot：080901-1)，缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin, IMA)檢測酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢華美公司)，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)試劑盒(南京建成公司)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)試劑盒(武漢華美公司)，原位細胞凋亡檢測試劑盒(Roch公司)。Caspase-8 、Bax、Bcl-2抗體(英國Abcam公司)，Caspase-3、Caspase-9、Fas/FasL、細胞色素C(Cytochrome C，Cyto-C)抗體(美國SantaCruz公司)，β-actin抗體(Sigma公司)，二抗(中杉金橋公司)，HRP顯色試劑盒(Piece公司)。

1.2 動物分組及模型制備

雄性SD大鼠24只，體重(325±28)g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間進行3次無負重適應(yīng)性游泳，每次 25 min。按照隨機數(shù)字表法分為4組(n=6)：對照組(Con)、力竭組(EE)、低劑量紅景天苷預(yù)處理力竭組(SLE)、高劑量紅景天苷預(yù)處理力竭組(SHE)。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，SLE、SHE組分別給予紅景天苷(15，30 mg/(kg·d))，Con組、EE組給予0.9%NaCl(3 ml/(kg·d))腹腔注射15 d。于給藥結(jié)束后次日正式實驗，正式實驗前動物禁食12 h。實驗時Con組不進行游泳訓(xùn)練。于腹腔給藥結(jié)束后次日EE組、SLE組、SHE組大鼠分別負體重質(zhì)量3%錫絲，按Thomas力竭標(biāo)準(zhǔn)，一次性游泳運動至力竭。大鼠游泳槽為清潔塑料圓桶，高60 cm，直徑55 cm，水深50 cm。水溫控制在32℃，上下浮動不超過1℃。力竭運動結(jié)束后即刻麻醉取材。

1.3 血清及心肌標(biāo)本采集及制備

對照組及力竭組大鼠戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，開胸下腔靜脈取血，3 000 r/min, 離心20 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取血后快速將心臟取出，用冷生理鹽水洗凈。于心尖部心室前壁肌切取小塊心肌組織，4%多聚甲醛中固定24 h后，用梯度濃度酒精行常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行切片，6～8張，厚度為4 μm，用涂有多聚賴氨酸的載玻片貼片，56℃烘烤40 min備用。其余心肌-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蘇木精-堿性復(fù)紅-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric acid，HBFP)染色法觀測心肌缺血缺氧面積

將心肌組織制成切片，切片脫蠟至水，蘇木素染液浸染5 min，流水沖洗5 min；1%鹽酸分化2～3 s，流水沖洗10 min；0.1%堿性紅液3 min，蒸餾水洗5～10 s；純丙酮5～10 min；0.1%苦味酸純丙酮浸染5～15 min；二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并攝片。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行圖像處理。測定每個視野的心肌缺血缺氧面積。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測IMA、cTnI、BNP血清含量

按照試劑盒操作步驟測定每組大鼠血清中IMA、cTnI、BNP含量，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處的OD值及標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本OD值計算各樣本濃度。

1.6 大鼠心肌細胞凋亡的原位標(biāo)記(TUNEL)檢測與半定量分析

細胞凋亡的原位標(biāo)記檢測是每一標(biāo)本取3個不同部位的切片各1張。脫蠟，再梯度水合后采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測。具體步驟按試劑盒說明書進行。每張切片隨機拍攝5個視野進行陽性細胞計數(shù)，以凋亡陽性細胞數(shù)所占百分比的平均值作為凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。

1.7 免疫組化檢測大鼠心肌Bax、Bcl-2含量

采用SP法, 按照試劑盒說明書, 陰性對照用PBS 代替一抗。若胞漿呈棕黃色背景，棕黃色顆粒沉積于細胞胞漿即陽性反應(yīng)；若細胞核及膜為藍色，其它部分顯示淡藍色即為陰性反應(yīng)。利用低倍、高倍光鏡著重觀察心肌組織的陽性反應(yīng)情況。結(jié)果用灰度值表示。

1.8 Western-blot法檢測大鼠心肌Fas、Cyto-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9含量

各組在適量細胞裂解液(已做冰預(yù)冷處理)中分別加入200 mg大鼠左心室前壁心肌組織，冰上裂解40 min。 4℃，12 000 r·min-1，離心20 min，之后收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，100 V 2 h轉(zhuǎn)PVDF膜，5%BSA封閉1 h，一抗稀釋濃度Fas 1∶500、Cyto-C 1∶ 1 000、Caspase-3 1∶1 000、Caspase-8 1∶500、Caspase-9 1∶500，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，后加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL檢測試劑盒顯影、洗片。 用Bandleader 5.0軟件對掃描后圖像進行灰度值分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對力竭運動大鼠心肌組織缺血缺氧面積的影響

HBFP染色結(jié)果顯示，Con組大鼠心室結(jié)構(gòu)大致正常，心肌纖維結(jié)構(gòu)相對清晰，染色均勻，各個細胞排列整齊規(guī)整，卵圓形細胞核呈藍黑色，位于細胞中央，未見明顯偏離；EE組中心肌纖維呈現(xiàn)多種形態(tài)，染色相對不均勻，細胞排列不整齊，胞漿內(nèi)有大量的片狀紅色缺血缺氧改變；SLE組與SHE組心肌結(jié)構(gòu)較EE組細胞排列更加規(guī)整，心肌纖維結(jié)構(gòu)更加清晰。胞漿內(nèi)有少量的片狀紅色缺血缺氧改變，缺血缺氧程度減輕。計算機圖像分析結(jié)果顯示：與Con相比，力竭組心肌缺血缺氧面積明顯增加(P< 0.01)。SLE組與SHE組心肌缺血、缺氧面積明顯少于EE組；且SHE組較SLE組缺血缺氧面積小(圖1)。

Con: Control group; EE: Acute exhaustive swimming group; SLE: Low dose sal pretreatment exhaustive swimming group; SHE: High dose sal pretreatment exhaustive swimming group

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△P<0.05vsSLE group

2.2 紅景天苷對力竭運動大鼠血清 IMA、cTnI、BNP含量的影響

與Con組相比，大鼠血清IMA含量EE組SLE和SHE組顯著升高(P<0.01)。SLE組和SHE組較EE組降低(P<0.01)，且SHE組較SLE組降低更為明顯(P<0.01)。血清cTnI、BNP水平與Con組比較，EE組、SLE組、SHE組均顯著升高(P<0.01)。SHE組明顯低于EE組(P<0.01，表1)。

IMA(U·ml-1)BNP(ng·L-1)c-TnI (pg·ml-1) Con15.31±1.98197.12±29.42126.81±13.48EE41.24±4.84??285.58±32.89??175.61±21.64??SLE32.09±2.06??##255.46±11.41??163.44±13.29??SHE18.85±2.17??##△△233.08±27.64??##154.20±20.42??##

IMA: Ischemia modified albumin; BNP: Brain natriuretic peptide; cTnI: Cardiac troponin I ; Con: Control group; EE: Acute exhaustive swimming group; SLE: Low does Sal pretreatment exhaustive swimming group; SHE: High does Sal pretreatment exhaustive swimming group

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△△P<0.01vsSLE group

2.3 紅景天苷對力竭運動大鼠心肌組織AI的影響

凋亡細胞即陽性細胞呈現(xiàn)棕黃色的細胞核。Con組偶見陽染顆粒，EE組出現(xiàn)較多散在的陽染顆粒，Sal干預(yù)組陽染顆粒有所減少。AI結(jié)果顯示：EE組和SLE組較Con組顯著升高(P<0.01)。SLE組和EE組兩組之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，SHE組AI降低明顯，與SLE組和EE組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01, 圖2)。

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△△P<0.05vsSLE group

2.4 紅景天苷對力竭運動大鼠心肌組織Bax，Bcl-2表達的影響

陽性信號定位于細胞漿和細胞膜，呈棕黃色細顆粒。對照組胞漿內(nèi)可見少量的Bax陽性表達，呈細顆粒狀，染色淺 。EE組心臟Bax陽性表達增強，胞漿內(nèi)可見大量的點狀或小塊狀棕褐色顆粒；Sal干預(yù)組陽性表達減少，SLE組內(nèi)可見較多的陽性表達顆粒，SHE組可見少量的棕褐色顆粒。計算機圖像分析結(jié)果顯示：Bax蛋白表達量EE組、SLE組和SHE組較Con組顯著升高(P<0.01)，SHE組和SLE組較EE組明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異。Bcl-2蛋白表達量EE組、SLE組較Con組顯著降低(P<0.01)，SHE組較EE、SLE組明顯升高(圖3)。

**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsEE group;△P<0.05vsSLE group

2.5 紅景天苷對力竭運動大鼠心肌Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的影響

EE組及SLE組Fas，Cyto-C，Caspase-3， Caspase-8，Caspase-9較Con組顯著升高(P<0.01)，SHE組Fas，Caspase-3，Caspase-8較Con組顯著升高。SLE組Fas，Cyto-C，Caspase-9和SHE組全部參數(shù)較EE組降低，均具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)，SHE組Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8較SLE組明顯降低，并具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)。

3 討論

本實驗證實Sal對力竭所致的心臟損傷具有保護作用。Sal可改善力竭運動造成的心肌缺血。Sal能降低Bax，增加Bcl-2的表達，降低Bax/Bcl-2比值，抑制死亡受體和線粒體凋亡通路中相關(guān)蛋白Fas、Cyto-C、Caspase-3，Caspase-8, Caspase-9的表達從而降低力竭心臟凋亡水平，發(fā)揮心臟保護作用。

*P<0.05,**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△P<0.05,△△P<0.01vsSLE group

力竭運動時心臟需氧量急劇增加，心肌血流相對供應(yīng)不足。此外，NO與內(nèi)皮素的失衡，冠脈血流量降低，均可誘發(fā)心肌缺血。本實驗HBFP染色表明力竭運動造成心肌缺血，與孫曉娟應(yīng)用跑臺進行力竭運動所得結(jié)果相同[8]。IMA是心肌缺血發(fā)生后到細胞壞死前的早期敏感特異指標(biāo)。其陽性結(jié)果表明心肌缺血。Lee在研究運動負荷試驗(EST)中發(fā)現(xiàn)IMA水平可預(yù)測EST后心肌缺血的嚴重程度[9]。紅景天苷可呈劑量依賴性減少力竭大鼠心肌缺血面積，降低IMA水平，提示紅景天苷可改善力竭運動導(dǎo)致的心肌缺血,但其機制需在今后研究中繼續(xù)探索。

心肌對缺血缺氧極其敏感，在缺血、缺氧的情況下，各種損害因子增多，脂質(zhì)過氧化水平增加，細胞膜穩(wěn)定性及完整性破壞，導(dǎo)致心肌細胞凋亡。心肌凋亡的程度與運動強度有一定的關(guān)系，適度的游泳訓(xùn)練降低心肌凋亡水平[10]。但持續(xù)大強度運動和力竭運動則通過細胞壞死和細胞凋亡兩種途徑使心肌出現(xiàn)損傷。本實驗亦顯示力竭運動后大鼠心肌細胞凋亡顯著增加。心肌細胞凋亡水平上調(diào)的直接后果就是心肌數(shù)量減少，導(dǎo)致心臟損傷。

Bcl-2家族中的抗凋亡成員Bcl-2和促凋亡成員Bax是細胞凋亡調(diào)控的重要基因，主要在凋亡執(zhí)行階段發(fā)揮作用。Bax/Bcl-2比值低，細胞存活率高。本實驗中力竭運動導(dǎo)致大鼠心肌細胞中Bax增加，Bcl-2減少，Bax/Bcl-2比值升高，導(dǎo)致細胞凋亡增加。類似報道還有力竭運動和過度訓(xùn)練可導(dǎo)致大鼠心肌細胞Bcl-2 mRNA表達下降，Bax mRNA水平升高，且二者比值明顯減小，心肌細胞凋亡顯著增加。

Fas是死亡受體介導(dǎo)凋亡途徑的啟動因子。Fas與FasL結(jié)合后可誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡信號，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-8，進一步活化效應(yīng)型Caspase-3，引起細胞凋亡事件發(fā)生。Caspase-3的表達增強可以增加組織細胞的凋亡。Caspase-8是死亡受體通路的關(guān)鍵起始因子，活化的Caspase-8還能把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來。Cyto-C是線粒體介導(dǎo)的凋亡通路的啟動因子之一。本實驗力竭運動造成心肌組織Fas、Cyto-C含量顯著增加。與金其貫、張鈞等人研究結(jié)果相同。力竭運動導(dǎo)致大鼠心肌細胞凋亡通路中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等相關(guān)凋亡蛋白顯著增加。與本實驗類似的研究也顯示，過度訓(xùn)練的大鼠腎組織Caspase-8的表達于力竭后即刻、6 h及24 h逐漸增強，均顯著高于對照組[11]。對青年男性專業(yè)運動員和大學(xué)生的研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動后即刻Caspase-3和Caspase-9的活性均顯著升高。孫曉娟發(fā)現(xiàn)力竭運動可使大鼠心肌細胞Caspase-3蛋白表達顯著升高，應(yīng)用抗氧化劑能夠抑制心肌細胞Caspase-3活性，減少心肌細胞凋亡數(shù)量[8]。紅景天苷劑量依賴性抑制力竭心臟死亡受體和線粒體凋亡通路中的Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表達，減少心肌細胞凋亡，保留盡可能多的心肌細胞，從而起到力竭心臟保護作用。