福建省鼠傷寒沙門菌β-內(nèi)酰胺耐藥表型及ESBLs耐藥基因分析

邱玉鋒,陳建輝,黃夢穎,楊勁松,林 杰,陳愛平,2

沙門菌是引起感染性腹瀉和食物中毒最常見的腸道病原菌之一，在我國沙門菌所引起的食源性疾病和食物中毒中一直位居前列[1]。目前臨床上常用于治療沙門菌病的藥物主要是喹諾酮類和第三代頭孢菌素類，第三代頭孢菌素因其獨特的藥效學、副作用較少成為治療沙門菌侵襲性感染和嚴重腹瀉的首選藥物。但是近年來隨著臨床抗生素的大量使用，世界各地均出現(xiàn)了大量三代頭孢類抗生素耐藥的沙門菌株[2]，特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)多重耐藥沙門菌株的出現(xiàn)，給臨床和食品衛(wèi)生安全造成巨大壓力。鼠傷寒沙門菌是沙門菌中數(shù)量最多，耐藥現(xiàn)象最嚴重的沙門菌血清型，鼠傷寒沙門菌對氯霉素、氨芐西林或卡那霉素等均已產(chǎn)生很強的耐藥性[3]，對喹諾酮和三代頭孢也產(chǎn)生了一定的耐藥。本文對分離自健康體檢者和腹瀉患者的鼠傷寒沙門菌進行了β-內(nèi)酰胺類藥物敏感性試驗及ESBLs相關耐藥基因檢測，初步分析了福建省鼠傷寒沙門菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥表型和耐藥基因型的相關性及ESBLs陽性菌的耐藥情況，為臨床使用β-內(nèi)酰胺類藥物治療沙門菌及沙門菌的防控工作提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取2012-2016年福建省福安和永安腹瀉患者臨床分離株61株，以及2000-2015年本單位食品從業(yè)者健康體檢分離株22株。所有83株實驗菌株均經(jīng)系統(tǒng)生化(API20E)及丹麥SSI血清鑒定為鼠傷寒沙門菌。

1.2 藥敏實驗方法

1.2.1藥敏測定 藥敏板購自上海星佰生物技術(shù)有限公司，實驗步驟按照說明書進行，具體包括: ① 挑取純菌培養(yǎng)的新鮮菌落于2～3 mL 滅菌生理鹽水中，用0.5麥氏濁度比濁，調(diào)制菌液濃度為1.5×108cfu/mL左右。② 取上述菌液60 μL，加入12 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液混勻進行稀釋，用12 通道微量移液器吸取稀釋液100 μL加入96 孔微量藥敏板條，陰性孔加100 μL無菌營養(yǎng)肉湯。③將板條放入恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)18～20 h，孵育后人工判讀菌株對各藥物的最低抑菌濃度(MIC)，并根據(jù)CLSI 2018《抗微生物藥敏敏感性實驗的執(zhí)行標準》[4]判斷相應的敏感、中度敏感和耐藥結(jié)果。大腸埃希菌ATCC25922 作為藥敏試驗質(zhì)控菌株確保結(jié)果的可靠性。

1.2.2產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株測定 采用最小抑菌濃度(MIC)法，包括初篩試驗和確認試驗，使用頭孢噻肟/頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶/頭孢他啶-克拉維酸，結(jié)果以加克拉維酸和不加克拉維酸MIC值相差3個對倍稀釋度以上作為確認。

1.3 耐藥基因PCR篩選

1.3.1模板制備 采用熱裂解法制備模板，挑取單個純菌培養(yǎng)的新鮮菌落于100 μL 純水中，制成懸濁液。100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清作為反應模板，-20 ℃保存以備用。

1.3.2PCR反應體系及條件 PCR反應總體積為20 μL，其中2×Taq PCR MasterMix (TaKaRa公司) 10 μL，上下游引物(10 μmol/L ) 各1 μL(引物由福州尚亞生物技術(shù)公司合成，序列見表1)，DNA 模板4 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應程序: 94 ℃預變性5 min，然后94 ℃ 30 s，50～57 ℃ 30 s，72 ℃ 30～60 s，進行33個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶與目標預計大小一致的送福州尚亞生物技術(shù)有限公司測序驗證。

1.4統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析, 采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，檢驗水準α設為0.05。

2 結(jié) 果

2.1鼠傷寒沙門菌β-內(nèi)酰胺類耐藥情況 除健康體檢者中分離的鼠傷寒沙門菌對頭孢菌素類和腹瀉患者中分離的菌株對亞安培南和美羅培南敏感外，兩類菌株對其他β-內(nèi)酰胺類藥物均有不同程度的耐藥，其中以氨芐西林和氨芐西林-舒巴坦的耐藥率較高。不同種類抗生素中腹瀉患者鼠傷寒分離株對頭孢菌素類具有一定的耐藥而健康體檢者均敏感，健康體檢者菌株中分別檢出1株亞胺培南和2株美羅培南耐藥菌株，而腹瀉患者菌株沒有檢出。10種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率在腹瀉患者和健康體檢者中比較，差異不具有統(tǒng)計學意義(見表2)。

表1 耐藥目的基因及其PCR引物序列
Tab.1 Drug resistant gene and its PCR primer sequence

NameSequence(5′-3′)Length/bpTm/℃ReferencesblaTEM-FATAAAATTCTTGAAGACGAAA108050[5-7]blaTEM-RGACAGTTACCAATGCTTAATCblaCTX-M-FCGCTTTGCGATGTGCAG55052[6-8]blaCTX-M-RACCGCGATATCGTTGGTblaOXA-FTCAACTTTCAAGATCGCA59149[4-5]blaOXA-RGTGTGTTTAGAATGGTGAblaSHV-FTTATCTCCCTGTTAGCCACC79550[4-6]blaSHV-RGATTTGCTGATTTCGCTCGGblaCTX-M-I-FGACGATGTCACTGGCTGAGC49955[9]blaCTX-M-I-FAGCCGCCGACGCTAATACAblaCTX-M-II-FGCGACCTGGTTAACTACAATCC35155[9]blaCTX-M-II-RCGGTAGTATTGCCCTTAAGCCblaCTX-M-III-FATGATGAGACATCGCGTTAAG86455[10]blaCTX-M-III-RCGGTGACGATTTTCGCGGCAGblaCTX-M-IV-FGCTGGAGAAAAGCAGCGGAG47455[10]blaCTX-M-IV-RGTAAGCTGACGCAACGTCTG

表2 鼠傷寒沙門菌β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥情況
Tab.2 Prevalence of β-lactamases antibiotic resistance inSalmonellatyphimurium

抗生素敏感(%)中度敏感(%)耐藥(%)健康體檢(n=22)腹瀉患者(n=61)健康體檢(n=22)患者(n=61)健康體檢(n=22)患者(n=61)氨芐西林13.6422.950.000.0086.3677.05氨芐西林-舒巴坦22.7322.9513.6434.4363.6442.62阿莫西林-克拉維酸22.7340.9872.7345.904.5513.11頭孢噻肟10081.970.001.640.0016.39頭孢他啶10086.890.004.920.008.20頭孢西丁10095.080.0016.670.004.92頭孢吡肟10080.330.003.280.0016.39氨曲南10077.050.003.280.0019.67亞胺培南95.451000.000.004.550.00美羅培南90.911000.000.009.100.00

2.2鼠傷寒沙門菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因篩查 除blaSHV基因未檢出外，ESBLs基因中blaTEM、blaCTX-M和blaOXA基因總體檢出率分別為46.99%(39/83)、12.05%(10/83)和19.28%(16/83)。其中61株分離自腹瀉患者菌株的blaTEM、blaCTX-M和blaOXA基因檢出率分別為55.74%(34/61)、19.39%(10/61)和19.67%(12/61)；22株分離自健康體檢者菌株的blaTEM和blaOXA基因檢出率分別為22.73%(5/22)和18.18%(4/22)，未檢出blaCTX-M基因(見表3)。腹瀉患者和健康體檢者blaTEM基因檢出率比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.073,P=0.008)，blaCTX-M和blaOXA基因檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義。另外，同時攜帶blaTEM和blaCTX-M基因的菌株5株，同時攜帶blaTEM和blaOXA基因的菌株4株，同時攜帶blaCTX-M和blaOXA基因的菌株4株，同時攜帶blaTEM、blaCTX-M和blaOXA3種基因的菌株2株。

表3 鼠傷寒沙門菌β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢出情況
Tab.3 Detection of β-lactamase resistance genes inSalmonellatyphimurium

blaTEM geneblaCTX-M geneblaOXA gene健康體檢(n=22)患者(n=61)健康體檢(n=22)患者(n=61)健康體檢(n=22)患者(n=61)檢出株數(shù)534010412檢出率/%22.7355.74016.3918.1819.67總檢出率/%46.9912.0519.28

通用引物檢出的10株blaCTX-M基因陽性菌株，分別用4組分組引物PCR擴增后陽性結(jié)果產(chǎn)物送測序，序列在NCBI比對結(jié)果表明blaCTX-M-14基因型4株、blaCTX-M-15和blaCTX-M-55基因型各3株。其中blaCTX-M-15和blaCTX-M-55型屬于I組，blaCTX-M-14型屬于IV組。

2.3腹瀉患者鼠傷寒沙門菌耐藥表型與耐藥基因型分析 61株腹瀉患者鼠傷寒沙門菌耐藥表型與基因型分析發(fā)現(xiàn)blaTEM基因與氨芐西林和氨芐西林-舒巴坦的相關性較高，一致性分析表明blaTEM基因與氨芐西林具有較好的一致性(P<0.001，Ka=0.546)，blaTEM基因與氨芐西林-舒巴坦的一致性較差(P=0.019，Ka=0.291)，(見表4)。blaCTX-M基因與氨芐西林、芐西林-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢他定、啶氨曲南和頭孢吡肟相關性較高，一致性分析表明blaCTX-M基因與頭孢噻肟和頭孢吡肟具有很好的一致性(P<0.001，Ka=1.000)，與頭孢他定(P<0.001，Ka=0.626)和氨曲南(P<0.001，Ka=0.668)也有較好的一致性。blaOXA基因與氨芐西林、芐西林-舒巴坦和阿莫西林-克拉維酸具有一定的相關性，但只有阿莫西林-克拉維酸具有較好的一致性(P=0.001，Ka=0.407)。

表4 腹瀉患者鼠傷寒沙門菌耐藥基因與表型關系
Tab.4 Correlation between drug resistance gene and phenotype ofSalmonellatyphimuriumin diarrhea patients

基因AMPAMSAMCCTXCAZAZMFEP耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感blaTEM陽性340195529592259529陰性1314720324522324720522blaCTX陽性10073371005582100陰性37141932546051051447051blaOXA陽性1026657210111111210陰性371220293468414451138841

注：AMP氨芐西林(AMP)，氨芐西林-舒巴坦(AMS)，阿莫西林克-拉維酸鉀(AMC)，頭孢噻肟(CTX)，頭孢他啶(CAZ)，氨曲南(AZM)，頭孢吡肟(FEP)。

2.4ESBLs陽性菌株耐藥特征及其耐藥基因分析

83株鼠傷寒沙門菌檢出ESBLs陽性10株，全部來源于腹瀉患者，檢出率16.39%。10株ESBLs陽性菌多重耐藥均在8耐或以上，其中一株對20種抗生素耐藥(見表5)。10株ESBLs陽性菌對亞胺培南和美羅培南均敏感，對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶氨曲南和頭孢吡肟均耐藥，其他藥物10株菌株各有不同的耐藥譜(見表5)。10株檢出的ESBLs菌株blaCTX-M基因全部陽性，其中5株同時blaTEM基因陽性，2株同時blaOXA基因陽性，blaCTX-M基因與ESBLs表型具有較好的一致性(P<0.001，Ka=1.000)。

表5 ESBLs鼠傷寒沙門菌耐藥譜特征
Tab.5 Antimicrobial resistance patterns of ESBLs inSalmonellatyphimurium

菌株編號ESBLs鼠傷寒沙門菌耐藥譜型Sal1AMP-AMS-TET-CHL-SXT-CFZ-CTX-GEN-NAL-AZM-Sul-CIP-AMC-MIN-FEP-DOX-KAN-STR-(18耐)Sal2AMP-AMS-TET-CFZ-CTX-GEN-Sul-AMC-MIN-AZM-FEP-DOX-STR-(13耐)Sal3AMP-TET-CFZ-CTX-MIN-AZM-FEP-DOX-(8耐)Sal4AMP-AMS-TET-CHL-CFZ-CTX-Sul-MIN-FEP-DOX-STR-(11耐)Sal5AMP-AMS-TET-CFZ-CTX-AZI-Sul-MIN-AZM-FEP-DOX-STR-(12耐)Sal6AMP-TET-CFZ-CTX-CAZ-MIN-AZM-FEP-DOX-(9耐)Sal7AMP-TET-CFZ-CTX-CAZ-MIN-AZM-FEP-DOX-(9耐)Sal8AMP-AMS-CFZ-CTX-CAZ-Sul-AZM-FEP-STR-(9耐)Sal9AMP-AMS-TET-CHL-SXT-CFZ-CTX-CAZ-GEN-NAL-Sul-CIP-AMC-CT-MIN-AZM-FEP-LEV-DOX-STR-(20耐)Sal10AMP-AMS-TET-CFZ-CTX-CAZ-Sul-MIN-AZM-FEP-DOX-STR(12耐)

注：氨芐西林(AMP)，氨芐西林-舒巴坦(AMS)，四環(huán)素(TET)，氯霉素(CHL)，復方新諾明(SXT)，頭孢唑林(CFZ)，頭孢噻肟(CTX)，頭孢他啶(CAZ)，慶大霉素(GEN)，萘啶酸(NAL)，磺胺異惡唑(Sul)，環(huán)丙沙星(CIP)，阿莫西林克-拉維酸鉀(AMC)，多粘菌素E(CT)，米諾環(huán)素(MIN)，氨曲南(AZM)，頭孢吡肟(FEP)，左氧氟沙星(LEV)，多西環(huán)素(DOX)，鏈霉素(STR)卡那霉素(KAN)。

3 討 論

β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用為人類抵御細菌性感染做出了巨大貢獻，但隨著抗生素的大量廣泛使用，細菌耐藥特別是由產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)介導的耐藥日益嚴重[11]。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥最重要的原因，近年來陸續(xù)有報道人群中產(chǎn)生耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的沙門菌[12-13]。本研究的藥敏結(jié)果表明兩類不同來源的鼠傷寒沙門菌對不同類型的β-內(nèi)酰胺類抗生素均有一定的耐藥，特別是青霉素類的氨芐西林和氨芐西林-舒巴坦具有較高的耐藥率。其中氨芐西林-舒巴坦高耐藥率可能與β-內(nèi)酰胺酶外的其他耐藥機制有關。腹瀉患者鼠傷寒已經(jīng)對頭孢菌素類也有了一定的耐藥，而健康體檢鼠傷寒對頭孢菌素比較敏感，這可能與健康體檢菌株來源年代比較久遠以及臨床頭孢菌素的大量使用有關，這與譚麗麗[14]，李柏生等[15]的研究結(jié)果相似。

沙門菌尤其是鼠傷寒沙門菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥主要也是由于產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶特別是ESBLs所導致的，ESBLs常見的型別為blaTEM型、blaCTX-M型、blaOXA型和blaSHV型, 最近有研究認為，blaCTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶已成為世界主要流行的ESBLs 分子表型[16]，而我國也以blaCTX-M型最為常見[17-18]。本研究共檢出blaTEM、blaCTX-M和blaOXA3個型別，未檢出blaSHV型，這與岳美娜[19]和魏金鳳[20]的檢出結(jié)果相似。3個耐藥基因型與相關β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型關系分析表明blaCTX-M基因主要介導頭孢菌素類耐藥，而blaTEM和blaOXA基因可能主要介導青霉素類耐藥，這與林蘭等[21]和陸彥等[22]的觀點相似。3個耐藥基因型與ESBLs菌株的表型分析進一步說明我省鼠傷寒沙門菌的ESBLs主要也是由blaCTX-M基因介導，由于本次檢出的ESBLs菌株數(shù)量較少，有待后續(xù)菌株更多時進一步分析。blaCTX-M型基因進一步測序分型表明其主要屬于blaCTX-M-14型、blaCTX-M-15和blaCTX-M-55型，其中5株ESBLs陽性菌株3株屬于blaCTX-M-55型，2株屬于blaCTX-M-15型，這與國內(nèi)近年blaCTX-M型β-內(nèi)酰胺酶類型的流行情況相同[23]。blaCTX-M基因可以通過依賴于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的水平傳播和垂直克隆擴增兩種方式，這使blaCTX-M基因可以在不同細菌之間以及親代與子代之間進行廣泛傳播，而攜帶blaCTX-M基因的ESBLs 陽性菌株通常都帶有多重耐藥，這給多重耐藥菌的防控造成巨大壓力。由于本研究監(jiān)測地區(qū)局限及健康體檢者來源株數(shù)量和年限有限，還需加大監(jiān)測范圍和食品來源的菌株進行監(jiān)測分析，以提供更全面的監(jiān)測資料。

綜上所述，福建省鼠傷寒沙門菌對β-內(nèi)酰胺酶類藥物中的青霉素類的耐藥率較高，對第三、四代頭孢菌素類和碳青霉烯類的耐藥率較低。但已檢出ESBLs耐藥基因blaTEM型、blaCTX-M型和blaOXA型且頭孢菌素類和ESBLs陽性主要由傳播方式多樣的blaCTX-M型基因介導，加上ESBLs菌株多耐藥現(xiàn)象嚴重，給防控工作帶來巨大挑戰(zhàn)。所以進一步研究沙門菌的耐藥傳播機制，檢測和監(jiān)測其耐藥性和耐藥基因，控制多重耐藥的產(chǎn)生和擴散是未來工作的重點。

利益沖突：無