李珺沬， 趙 甜， 劉 巖， 劉圓呈， 魯雅潔， 蔣 曄*

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017)

黃曲霉毒素(Aflatoxins)具有高毒性和高致癌、致畸、致突變性，它們對人類和動物危害極大[1 - 2]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)相似且特征已知的黃曲霉毒素類化合物。其中，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2是主要的毒性物質(zhì)[3 - 4]。目前，對于黃曲霉毒素的研究主要集中于食品和農(nóng)畜產(chǎn)品[5 - 6]，而對中藥材中黃曲霉毒素的相關(guān)研究報道較少。中藥材在加工、儲藏和運輸?shù)倪^程中，很容易發(fā)生霉變，產(chǎn)生或被黃曲霉毒素污染[7 - 8]。同時，由于黃曲霉毒素不溶于水，并且耐熱性很高，加熱到280 ℃才能發(fā)生裂解破壞[9]。因此，測定中藥材、中藥飲片和中藥制劑中的黃曲霉毒素對保證用藥安全具有重要的意義。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[10]、薄層色譜法[11]、熒光分光光度法[12]、免疫親和柱-高效液相色譜法[13]等。但是這些方法存在穩(wěn)定性差、假陽性較多、特異性差、靈敏度低等弊端。

攪拌棒吸附萃取(Stir Bar Sorptive Extraction，SBSE)是一種集萃取、富集、凈化為一體的新型樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡便、溶劑用量少、富集倍數(shù)高和環(huán)境友好等優(yōu)點[14 - 16]。氧化石墨烯具有較高的比表面積和豐富的含氧官能團(tuán)，近年來以氧化石墨烯作為吸附材料，被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境污染物等的前處理研究[17 - 18]。本研究通過制備多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物為涂層的攪拌棒，并用該攪拌棒萃取中藥材陳皮中的黃曲霉毒素，同時結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測器對其進(jìn)行檢測。方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點，為中藥中黃曲霉毒素的測定提供了一種有效的分析手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

L-6200A高效液相色譜儀(日本，Hitachi公司)；2475熒光檢測器(美國，Waters公司)；柱后衍生系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；DF-11集熱式磁力攪拌器(金壇市富華儀器有限公司)；HGC-24型氮吹儀(天津恒高技術(shù)有限公司)；H1650臺式離心機(jī)(湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司)；TYD-300超聲清洗器(北京泰元達(dá)創(chuàng)公司)。

黃曲霉毒素(AF)對照品溶液(美國Sigma公司)；多巴胺(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；氧化石墨烯水分散液(濟(jì)寧利特納米技術(shù)有限責(zé)任公司)；碘(濟(jì)南蕭試化工有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；所有其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液精密量取AF B1、AF B2、AF G1、AF G2對照品溶液適量，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度分別為200、50、200、50 ng/mL的混合對照品儲備液。

1.2.2 樣品溶液精密稱取已粉碎并過二號篩的陳皮樣品粉末約1 g，置于10 mL離心管中，加入0.2 g NaCl，精密加入70%甲醇溶液5 mL[19]，超聲5 min，于2 500 r/min離心5 min，精密將取上清液1 mL，置于10 mL西林瓶中，加超純水稀釋至10 mL，備用。

1.3 攪拌棒的制備

參考文獻(xiàn)方法[18 - 20]制備攪拌棒。具體方法如下：取含磁子的四氟攪拌棒，置于含2 mg/mL多巴胺的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)的燒杯中，于30 ℃磁力攪拌水浴鍋中緩慢勻速攪拌12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min，將攪拌棒置于2 mg/mL的氧化石墨烯水分散液中，于65 ℃磁力攪拌水浴鍋中反應(yīng)12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min。重復(fù)以上操作步驟3次，得到具有一定多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層厚度的攪拌棒。

1.4 攪拌棒吸附萃取過程

將自制的攪拌棒置于“1.2.2”項下制備的樣品溶液中，在磁力攪拌水浴鍋中萃取(溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min)20 min，取出攪拌棒，于2 mL甲醇中解吸(攪拌速率為300 r/min)2 min，解吸液于45 ℃氮氣流下吹干，并用0.1 mL色譜流動相復(fù)溶后，用于高效液相色譜分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-水=40∶18∶42(V/V/V)；流動相流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測：λex=360 nm，λem=450 nm；衍生溶液：0.05%碘溶液，流速：0.3 mL/min；衍生溫度：70 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌棒涂層厚度的考察

圖1 涂層厚度對萃取效率的影響Fig.1 Effect of coating thickness on extraction efficiency

攪拌棒的涂層厚度對萃取效率具有重要影響。本實驗考察了在含磁子的四氟攪拌子上，分別涂布1～4層多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物后，對AF B1、AF B2、AF G1、AF G2 萃取效率的影響，如圖1所示。結(jié)果顯示，當(dāng)攪拌棒的涂層為3層時，對4種黃曲霉毒素即可達(dá)到最大吸附能力。因此，本實驗選擇3層厚度的多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物涂層攪拌棒對目標(biāo)組分進(jìn)行萃取。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 攪拌速率的優(yōu)化適度的攪拌可以加快固液界面的更新，減小溶液中待測組分的濃度梯度，增加待測組分向萃取基質(zhì)中的擴(kuò)散速率，從而縮短萃取時間。本實驗考察了不同的攪拌速率(100～500 r/min)對萃取效率的影響，如圖2所示。結(jié)果顯示，隨著攪拌速率的增大，目標(biāo)組分的萃取量逐漸增加，當(dāng)攪拌速率大于300 r/min時，萃取效率反而降低。因此，選擇最佳攪拌速度為300 r/min。

2.2.2 鹽效應(yīng)的影響實驗在溶液中加入NaCl來調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，考察其對萃取效率的影響。分別加入NaCl質(zhì)量濃度為0%、1%、2%、3%、4%，如圖3所示。結(jié)果顯示，隨著離子強(qiáng)度的增加，攪拌棒對4種黃曲霉毒素的萃取效率逐漸降低。因此，為獲得最佳萃取條件，本實驗不加入NaCl。

圖2 攪拌速率對萃取效率的影響Fig.2 Effect of stirring rate on extraction efficiency

圖3 鹽濃度應(yīng)對萃取效率的影響Fig.3 Effect of salt concentration on extraction efficiency

2.2.3 萃取溫度的優(yōu)化萃取溫度對萃取效率具有重要影響。萃取溫度升高，目標(biāo)組分的傳質(zhì)速率加快，但同時目標(biāo)組分在萃取相內(nèi)的分配系數(shù)降低。本實驗考察了萃取溫度為30、40、50、60、70 ℃對萃取效率的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，當(dāng)萃取溫度達(dá)到50 ℃時，萃取效率達(dá)到最高。因此，本實驗選擇最佳萃取溫度為50 ℃。

2.2.4 萃取時間的優(yōu)化考察不同萃取時間對萃取效果的影響，以色譜峰面積對萃取時間作圖，如圖5所示。結(jié)果顯示，從5 min到20 min，隨著萃取時間的增加，目標(biāo)組分的萃取效率逐漸增大，在20 min時達(dá)到峰值。隨后，繼續(xù)延長萃取時間至40 min，其響應(yīng)值增加不超過2%。在充分權(quán)衡靈敏度和實驗效率的情況下，本實驗選擇20 min作為最佳萃取時間。

圖4 萃取溫度對萃取效率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

圖5 萃取時間對萃取效率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.3 解吸條件的優(yōu)化

相對于靜態(tài)解吸，動態(tài)解吸能夠加快溶液對流，提高溶液中待測組分的傳質(zhì)速度，加快解吸速率，從而縮短解吸時間。本實驗分別考察了超聲和攪拌兩種模式對待測組分解吸效果的影響。實驗結(jié)果表明：超聲20 min后，攪拌棒的涂層有損失，不利于攪拌棒的重復(fù)利用；而在攪拌模式下，涂層穩(wěn)定，因此采用攪拌模式對待測組分進(jìn)行解吸。實驗分別考察了不同攪拌速率(100、200、300、400、500 r/min)和不同解吸時間(0.5、1、2、3、4 min)的解吸效果，結(jié)果顯示攪拌速率為300 r/min、解吸時間為2 min時，解吸效果最佳，因此確定該條件作為解吸條件。

2.4 攪拌棒的耐用性考察

本實驗考察了攪拌棒的耐用性進(jìn)。攪拌棒完成1次萃取后，依次用超純水和甲醇攪拌(300 r/min)各清洗1 min，重復(fù)清洗2次，取出攪拌棒，置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥，以備重復(fù)利用。在本實驗中，取同一批不含黃曲霉毒的陳皮樣品，平行制備30份加標(biāo)樣品，經(jīng)70%的甲醇溶液超聲提取后，用于萃取，以黃曲霉毒的色譜峰面積作為測量參數(shù)，結(jié)果表明：前25份加標(biāo)樣品測定的各待測組分的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.1%，30份加標(biāo)樣品測定的各待測組分的峰面積的RSD為7.5%，說明所制備的攪拌棒具有良好的耐用性。由于攪拌棒可以批量制備，數(shù)量充足，因此，在本實驗中考慮到測量結(jié)果的重現(xiàn)性，攪拌棒重復(fù)使用20次后即不再繼續(xù)使用。

2.5 方法學(xué)研究與評價

精密吸取含AF B1、AF B2、AF G1和AF G2的混合對照品儲備液適量，用甲醇逐級稀釋成含4種目標(biāo)物的系列混合對照品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比(S/N)=3計，得到該方法的檢出限，相關(guān)數(shù)據(jù)均列入表1。取不被黃曲霉毒素污染的陳皮樣品，分別向其中添加低、中、高3個濃度水平的混合對照品溶液，測定加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表2。

表1 方法的線性實驗結(jié)果和檢出限

表2 加標(biāo)回收率和精密度(RSD,n=5)結(jié)果

圖6 混合對照品溶液(a)和陽性陳皮樣品(b)色譜圖Fig.6 Chromatograms of standards(a) and Pericarpium Citri Reticulatae containing AF B1(b)1.AF G2;2.AF G1;3.AF B2;4.AF B1.

2.6 實際樣品分析

在各大型零售藥店和藥材市場隨機(jī)購買12批陳皮樣品，采用自制的攪拌棒對黃曲霉毒素進(jìn)行萃取，并進(jìn)行HPLC-FLD分析，色譜圖如圖6所示。測定結(jié)果表明：1份陳皮樣品檢測出AF B1，含量為0.8 μg/kg，未超過《中國藥典》規(guī)定的陳皮中AF B1的最大限量標(biāo)準(zhǔn)5 μg/kg[21]，其它陳皮樣品中未見上述4種黃曲霉毒素檢出，所有陳皮樣品檢測合格率為100%。

3 結(jié)論

本研究通過制備多巴胺-氧化石墨烯復(fù)合物為涂層的攪拌棒對中藥材陳皮中的AF B1、AF B2、AF G1和AF G2進(jìn)行萃取，并結(jié)合HPLC-FLD對其進(jìn)行測定。實驗所制備的攪拌棒耐受性好，重復(fù)使用次數(shù)高。在優(yōu)化的條件下，對12批陳皮樣品進(jìn)行測定，檢測結(jié)果均未超過《中國藥典》規(guī)定的最大限量標(biāo)準(zhǔn)。該方法操作簡便，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，能夠滿足陳皮中黃曲霉毒素的測定要求，同時對其它中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中黃曲霉毒素的測定具有一定的借鑒意義。