不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤的毒性影響的比較研究?

董輝輝， 韓 萃， 沈 陽， 孫 躍， 朱麗巖， 王 騰， 戴玲靈

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

TBBPA(Tetrabromobisphenol A， TBBPA)是目前全球應(yīng)用最廣泛、使用量最高的溴系阻燃劑(Brominated Flame Retardant， BFRs)之一。TBBPA具有半揮發(fā)性，會(huì)從產(chǎn)品釋放到環(huán)境中，并利用高親脂性在生物體內(nèi)蓄積，隨著TBBPA在生活生產(chǎn)過程中的廣泛使用，其在各類環(huán)境介質(zhì)和生物體中的含量不斷增加[1]，在空氣、土壤、底泥和水生生物體內(nèi)均已檢測出TBBPA，甚至在人體血液和母乳中也有檢出報(bào)道[2-4]。而且近些年來TBBPA被認(rèn)為是八溴聯(lián)苯醚和五溴聯(lián)苯醚的替代品，其使用量仍在持續(xù)增長[5]。TBBPA 的大量使用，帶來了相應(yīng)的環(huán)境問題，因此近年來國內(nèi)外研究者越來越重視對(duì)TBBPA生態(tài)毒理效應(yīng)的研究。

橈足類(Copepoda)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼亞門(Crustacea)，是一類種類多、數(shù)量龐大且分布廣泛的小型低等甲殼動(dòng)物[6]，既是浮游植物的攝食者，又是魚類的餌料基礎(chǔ)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中有不可替代的作用。日本虎斑猛水蚤具有世代周期短，繁殖力強(qiáng)，且易于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的特點(diǎn)，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于毒性污染物( 如內(nèi)分泌干擾物、以及金屬污染物)的檢測[7-8]，是開展生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)的理想生物[9]。

污染物不同的暴露方式是影響污染物在生物體內(nèi)積累的關(guān)鍵因素[10-11]，目前橈足類毒理學(xué)研究多以水體暴露的方式進(jìn)行，通過餌料暴露的慢毒性研究鮮少涉及。自然環(huán)境中污染物不僅可以直接對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性效應(yīng)，還可以通過食物鏈進(jìn)入捕食者體內(nèi)進(jìn)而產(chǎn)生影響，因而單獨(dú)的水體暴露并不能完全說明污染物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。

本研究以日本虎斑猛水蚤作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究水體暴露和餌料暴露兩種方式下，TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤繁殖和發(fā)育的影響，加入餌料暴露可以使實(shí)驗(yàn)條件更加接近于自然狀態(tài)，更加全面地反映TBBPA的潛在危害。本研究可為評(píng)估TBBPA對(duì)海洋無脊椎動(dòng)物的影響提供資料與方法，對(duì)TBBPA的監(jiān)控和治理具有重要意義。

1 材料與方法[12-14]

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試生物采集與培養(yǎng) 日本虎斑猛水蚤采自青島匯泉灣附近海域，已在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)多代，室內(nèi)培養(yǎng)條件為溫度(20±1)℃，鹽度(30±1)，光周期 12 h L∶12 h D。培養(yǎng)所用的海水經(jīng)0.45 μm孔徑的濾膜過濾，充分曝氣24 h后使用。實(shí)驗(yàn)餌料為6.3× 104cells/mL青島大扁藻(Platymonashelgolandica)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 實(shí)驗(yàn)使用的TBBPA固體和二甲基亞砜(DMSO)均為分析純，分別購自J&K化學(xué)試劑有限公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，TBBPA 純度 > 98% 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)定空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組D(助溶劑為二甲亞砜DMSO)、1.06、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg·L-1TBBPA共8組。每組有三個(gè)平行，每個(gè)平行組挑選20只健康活潑的日本虎斑猛水蚤。培養(yǎng)條件同上，每隔24 h觀察并記錄日本虎斑猛水蚤的死亡情況，并更換50%的對(duì)應(yīng)溶液。

1.2.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn) 有實(shí)驗(yàn)表明[15]，藻細(xì)胞在96 h時(shí)達(dá)到最大富集量和最大富集系數(shù)，，因此根據(jù)96h-LC50本實(shí)驗(yàn)將扁藻提前放入1/10 96h-LC50即0.31 mg/L的TBBPA中進(jìn)行96 h染毒。

實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組、餌料暴露組和水體暴露組三組。溶劑對(duì)照組，海水中TBBPA濃度為0 mg·L-1，投喂未經(jīng)染毒的青島大扁藻；水體暴露組，海水中TBBPA濃度為0.31 mg·L-1，投喂未經(jīng)染毒的餌料；餌料暴露組，海水中TBBPA濃度為0 mg·L-1，投喂在0.31 mg·L-1的TBBPA中染毒96 h的青島大扁藻。各組均有3個(gè)平行，每個(gè)平行挑選24只無節(jié)幼蟲至24孔板進(jìn)行單只培養(yǎng)并記錄發(fā)育時(shí)間、首次掛卵雌體出現(xiàn)時(shí)間和產(chǎn)卵量等指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件分析處理。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性影響

急性毒性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組及溶劑對(duì)照組中日本虎斑猛水蚤未觀察到死亡現(xiàn)象，這表明實(shí)驗(yàn)中沒有溶劑效應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組日本虎斑猛水蚤存活率隨著TBBPA濃度的升高而逐漸下降，96 h時(shí)8.1 mg/LTBBPA組死亡率達(dá)到100%(見圖1)。運(yùn)用軟件SPSS 19.0分析求出TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50為3.1 mg/L，其95%可信區(qū)間為2.841～3.311 mg·L-1，做回歸曲線擬合得出TBBPA濃度與日本虎斑猛水蚤96 h存活率的二次曲線方程為y=105.63+1.3x-1.99x2，二次曲線模型擬合度為0.95，P<0.01(見表1)。

圖1 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤96 h的存活率Fig.1 The survival rate of T. japonicus exposed to TBBPA in 96 h

暴露時(shí)間①回歸方程②R2顯著性水平③半致死濃度④96 h y=105.63+1.3x-1.99x20.95P<0.013.1 mg·L-1

注：①Exposure time；②Regression equation；③Significant level；④LC50

2.2 慢性毒性試驗(yàn)

2.2.1 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤發(fā)育的影響 2種暴露方式下TBBPA未對(duì)日本虎斑猛水蚤的發(fā)育率產(chǎn)生顯著影響(見圖2)。對(duì)照組、餌料暴露組和水體暴露組日本虎斑猛水蚤無節(jié)幼蟲發(fā)育成功率均在90%以上，分別為 98.77%、91.03%和96.94%。與其他兩組相比，餌料暴露組發(fā)育成功率略低，但各組間無顯著差異(P>0.05)。

(D組為DMSO對(duì)照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖2 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本 虎斑猛水蚤無節(jié)幼蟲變態(tài)率的影響
Fig.2 Effects of TBBPA on metamorphsis rate ofT.japonicusin different exposure modes

對(duì)照組、水體暴露組和餌料暴露組中日本虎斑猛水蚤無節(jié)幼蟲發(fā)育至橈足幼體的時(shí)間分別為4.76、4.87和4.69 d，各組間無顯著差異(P>0.05)(見圖3)。與對(duì)照組相比，水體暴露組橈足幼體發(fā)育至成熟個(gè)體的時(shí)間有所延長，但與對(duì)照組間沒有顯著差異(P>0.05)；餌料暴露明顯縮短了橈足幼體發(fā)育至成熟個(gè)體的時(shí)間，與對(duì)照組和水體暴露組均有顯著差異(P<0.05)。

(D組為DMSO對(duì)照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖3 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本 虎斑猛水蚤發(fā)育時(shí)間的影響
Fig.3 Effects of TBBPA on development time ofT.japonicusin different exposure modes

2.2.2 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤繁殖的影響 2種暴露方式下TBBPA均縮短了日本虎斑猛水蚤首只掛卵雌體出現(xiàn)的時(shí)間(見圖4)。對(duì)照組、餌料暴露組和水體暴露日本虎斑猛水蚤第一只掛卵雌體出現(xiàn)的時(shí)間分別為16.67、13.33和14.33 d。數(shù)據(jù)分析顯示僅餌料暴露組與對(duì)照組間有顯著性差異(P<0.05)。

(D組為DMSO對(duì)照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖4 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎斑 猛水蚤首只掛卵雌體出現(xiàn)時(shí)間的影響
Fig.4 Effects of TBBPA on the fist female mature time ofT.japonicusin different exposure modes

兩種暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤的平均產(chǎn)卵量產(chǎn)生了不同的影響(見圖5)。平均產(chǎn)卵量水體暴露組<對(duì)照組<餌料暴露組。與對(duì)照組相比，水體暴露組雌體平均產(chǎn)卵量略微減少(P>0.05)；餌料暴露組產(chǎn)卵量與對(duì)照組相比增加顯著(P<0.05)，與水體暴露組相比增加極顯著(P<0.01)。

(D組為DMSO對(duì)照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖5 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本 虎斑猛水蚤平均產(chǎn)卵量的影響
Fig.5 Effects of TBBPA on eggs female ofT.japonicusin different exposure modes

對(duì)照組，水體暴露組和餌料暴露組日本虎斑猛水蚤的產(chǎn)卵間隔分別為3.14、2.97和3.15 d(見圖6)，各組間均無明顯差異(P>0.05)。

(D組為DMSO對(duì)照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖6 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎 斑猛水蚤卵囊發(fā)育時(shí)間的影響
Fig. 6 Effects of TBBPA on oocyst development time ofT.japonicusin different exposure modes

如圖7所示，對(duì)照組、餌料暴露組和水體暴露組日本虎斑猛水蚤完成一次生活史所需的時(shí)間分別為22.20、18.93和21.69 d。與對(duì)照組比，水體暴露組無顯著差異(P>0.05)；餌料暴露組明顯縮短了日本虎斑猛水蚤的生活史周期(P<0.01)。

(D組為DMSO對(duì)照組；不同字母P<0.05；相同字母P>0.05。 The solvent control group is abbreviated as D; Different lettersP<0.05; Same lettersP>0.05.)

圖7 不同暴露方式下TBBPA對(duì)日本虎斑 猛水蚤完成一次生活史所需的影響
Fig. 7 Effects of TBBPA on life cycle ofT.japonicusin different exposure modes

3 討論

TBBPA是一種持久性有機(jī)污染物(POPs)和潛在的內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals， EDCs)，有研究顯示，與五溴聯(lián)苯醚(BDE)和六溴環(huán)十二烷(HBCD)等溴代物相比，其具有甲狀腺干擾性、免疫和細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性以及雌激素干擾性等毒性效應(yīng)，對(duì)生物的毒性更高[1,16]。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與哺乳動(dòng)物相比，TBBPA對(duì)水生生物毒性更高[17]，如海洋藻類、水蚤、糠蝦及魚類對(duì)TBBPA 均比較敏感。國際化學(xué)品安全規(guī)劃署( IPCS，International Program on Chemical Safety)公布的TBBPA對(duì)虹鱒魚(Salmogairdneri)、藍(lán)鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)和黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)的96h-LC50分別為0.4、0.51和0.54 mg·L-1，對(duì)糠蝦(Mysidopsisbahia)和大型溞(Paphniamagna)的LC50接近1 mg/L(IPCS，1995 )[18]。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則(HJ/T154-2004)》的毒性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，TBBPA對(duì)多數(shù)水生生物的急性毒性均在高毒性甚至極高毒性水平[19]。

本研究測得TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50為3.1 mg·L-1。之前的研究結(jié)果顯示，TBBPA對(duì)中華哲水蚤[12](Calanussinicus)和太平洋真寬水蚤[13](Eurytemorapacifica)的96 h-LC50分為427.6和178 μg·L-1，對(duì)擬長腹劍水蚤[20](Oithonasimilis)48 h-LC50為3.106 mg·L-1。這表明，不同橈足類對(duì)TBBPA的耐受能力存在差異，日本虎斑猛水蚤對(duì)TBBPA的耐受性相對(duì)較高。徐風(fēng)風(fēng)[21]在研究四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)對(duì)橈足類的急性毒性試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)污染物對(duì)不同橈足類的急性毒性存在差異，BDE-47對(duì)日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50約為太平洋真寬水蚤的15倍。Rajendran 和 Venugopalan[22]的研究中DDT對(duì)橈足類真哲水蚤(Eucalanussp.)和紡錘水蚤(Acartiasp.)的24 h-LC50也差異顯著分別為12和28 μg·L-1。綜上所述，橈足類對(duì)有機(jī)污染物的敏感性具有物種差異性。

本實(shí)驗(yàn)中，餌料暴露組明顯縮短日本虎斑猛水蚤幼體發(fā)育至成體的時(shí)間和生活史，這是因?yàn)闃镒泐愒诟靼l(fā)育期的發(fā)育時(shí)間受生理制約和外界壓力的共同影響[23]，而暴露于TBBPA后日本虎斑猛水蚤的攝食率和代謝速率會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響其生長發(fā)育。之前就有研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的污染物可促進(jìn)橈足類攝食、加快代謝速度和縮短生活史周期[24]。韓萃等[20]發(fā)現(xiàn)，低濃度的TBBPA(0.031 mg·L-1)可促進(jìn)了擬長腹劍水蚤的發(fā)育。王曉敏等[25]的研究同樣發(fā)現(xiàn)低濃度的污染物可以縮短橈足類發(fā)育至成熟個(gè)體的時(shí)間。鞏文靜[26]等發(fā)現(xiàn)TBBPA暴露能誘導(dǎo)加快擬長腹劍水蚤的攝食速率。徐風(fēng)風(fēng)等[21]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)BDE-47能促進(jìn)太平洋真寬水蚤的攝食率和濾水率，會(huì)增加日本虎斑猛水蚤的攝食率、濾水率、耗氧率和排氨率。綜上，推測TBBPA可以通過影響日本虎斑猛水蚤的代謝速率進(jìn)而影響其在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的積累，最終導(dǎo)致發(fā)育時(shí)間以及生活史周期的變化。實(shí)驗(yàn)中無節(jié)幼體變態(tài)時(shí)間并沒有受到TBBPA的毒性影響，可能是因?yàn)槿毡净呙退闊o節(jié)幼蟲期對(duì)青島大扁藻的攝食量較低，體內(nèi)蓄積的TBBPA不足以產(chǎn)生毒性效應(yīng)。鄭重等[27]就曾指出橈足類無節(jié)幼蟲期可分為六期，前三期依靠卵黃為生，第Ⅳ期才開始進(jìn)行攝食。另外，還有研究表明，污染物會(huì)干擾橈足類蛻皮激素的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致蛻皮過程的紊亂，進(jìn)而影響橈足類的發(fā)育時(shí)間[28-29]。在之后的研究中，探究TBBPA對(duì)橈足類蛻皮激素的影響，有利于我們更好的了解TBBPA的毒性作用機(jī)制。

相比對(duì)照組，餌料暴露組日本虎斑猛水蚤第一只掛卵雌體出現(xiàn)的時(shí)間明顯縮短。這是因?yàn)門BBPA具有弱的雌激素效應(yīng)[30]，在一定濃度范圍內(nèi)會(huì)促進(jìn)日本虎斑猛水蚤水蚤卵巢的成熟。Andersen等[31]也發(fā)現(xiàn)低濃度的雙酚A(20 μg·L-1)能刺激湯氏紡錘水蚤(Acartiatonsa)卵巢的成熟。餌料暴露組日本虎斑猛水蚤卵囊發(fā)育時(shí)間的略微縮短和產(chǎn)卵量的顯著增加，表明在一定的污染物濃度范圍內(nèi)，面對(duì)脅迫橈足類傾向于分配更多的能量用于個(gè)體的繁殖。Walthall W K和Michalek-Wagner K等[32-33]研究也發(fā)現(xiàn)，逆境條件下生物體會(huì)進(jìn)行能量重新分配，通過增加生殖量來掩蓋死亡率的上升，以維持種群穩(wěn)定。Andersen H R和季更生等[31,34]也發(fā)現(xiàn)，一定濃度的污染物的刺激可引起橈足類產(chǎn)卵率增高。Siu 等[35]的研究中0.2 μg·L-1多氯聯(lián)苯提高了火腿偽鏢水蚤的產(chǎn)卵率。此外，一定污染物濃度范圍內(nèi)，污染物可刺激橈足類攝食增加、代謝速度加快[24]，進(jìn)而引起產(chǎn)卵率增高[31]。另外，本研究只觀察了TBBPA對(duì)日本虎斑猛水蚤單世代生殖力的變化，TBBPA的多世代暴露下橈足類的生殖策略是否會(huì)發(fā)生改變需要進(jìn)一步的探究。

兩種暴露方式下，僅餌料暴露組對(duì)日本虎斑猛水蚤的發(fā)育、繁殖產(chǎn)生了影響，這表明暴露方式會(huì)影響TBBPA在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的蓄積。之前也有研究發(fā)現(xiàn)，污染物在生物體內(nèi)的蓄積受多種因素的影響，如：污染物的理化性質(zhì)、生物體自身的代謝能力、年齡、性別以及污染物暴露濃度、方式和環(huán)境因素等，其中污染物不同的暴露方式是影響污染物在生物體內(nèi)積累的關(guān)鍵因素[10-11]。TBBPA水體暴露未對(duì)日本虎斑猛水蚤發(fā)育、繁殖產(chǎn)生影響，可能是因?yàn)槿毡净呙退轶w表有幾丁質(zhì)外殼的保護(hù)，可以有效地阻止污染物的滲入，水體中僅有極少量的TBBPA可以進(jìn)入日本虎斑猛水蚤體內(nèi)。Mauchline[36]也曾報(bào)道橈足類很少或幾乎不能通過體表吸收海水中的污染物。而餌料暴露組中扁藻蓄積的TBBPA通過食物鏈直接傳至日本虎斑猛水蚤并在其體內(nèi)進(jìn)行較為快速地蓄積。Wallberg 等[37]就曾指出營養(yǎng)轉(zhuǎn)移是疏水性有機(jī)污染物沿浮游生物群落轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要途徑。Zhang Q等[38]發(fā)現(xiàn)攝食積累是海洋橈足類和魚類中二噁英積累的主要途徑。Magnusson, K等[39]的研究證明食物攝取是EDCs營養(yǎng)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑。另外，在研究重金屬對(duì)橈足類的的毒性影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了暴露方式會(huì)影響毒物在橈足類體內(nèi)的蓄積。王文雄等[40]發(fā)現(xiàn)海洋動(dòng)物(包括無脊椎動(dòng)物和魚類)中富集重金屬的主要途徑是食物暴露。Hook SE等[41-42]的研究顯示藻類暴露于遠(yuǎn)低于安全濃度以下的重金屬后被橈足類攝食，會(huì)導(dǎo)致橈足類的正常繁殖活動(dòng)受抑，餌料暴露會(huì)使橈足類體內(nèi)重金屬負(fù)荷成倍增加。此外，Gretchen等[43]研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，湯氏紡錘水蚤直接暴露于水體低濃度重金屬未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，一旦以提前暴露的浮游植物作為橈足類的餌料，其繁殖則受到顯著影響。雖然環(huán)境脅迫不盡相同，但上述結(jié)果與本研究的結(jié)果基本一致。

綜上所述，TBBPA會(huì)對(duì)日本虎斑猛水蚤的生殖發(fā)育產(chǎn)生影響，發(fā)育時(shí)間和繁殖力對(duì)毒物的敏感性較高，具有在低濃度下可檢測的特點(diǎn)。TBBPA餌料暴露對(duì)日本虎斑猛水蚤的影響更大，暴露方式會(huì)影響TBBPA在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的積累速率。