蕪湖地區(qū)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及耐藥情況分析

陳繼梅 李雪琳

蕪湖市第三人民醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000

結(jié)核病是全球第九大死亡原因，已成為一個(gè)嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題，是死亡率最高的由單病因所引起的傳染性疾病。2016年，全球估計(jì)有130萬(wàn)結(jié)核病患者[1]，其中56%發(fā)生在5個(gè)國(guó)家:印度、印度尼西亞、中國(guó)、菲律賓和巴基斯坦。2016年中有60萬(wàn)新病例對(duì)抗利福平(RRTB)，這是一種最有效的一線(xiàn)藥物，其中49萬(wàn)為耐多藥結(jié)核(MDR-TB)，印度、中國(guó)和俄羅斯聯(lián)邦[1]等三國(guó)的MDR發(fā)生率占近一半(47%)。令人擔(dān)憂(yōu)的情況是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的發(fā)病率正在升高，對(duì)人類(lèi)重大挑戰(zhàn)是廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)。XDR-TB病例和越來(lái)越多的耐多藥結(jié)核病例，導(dǎo)致治療結(jié)果不佳和死亡率高，在MDR/XDR-TB患者中，控制耐藥性、減少傳播和改善治療結(jié)果依賴(lài)于結(jié)核桿菌藥物敏感性測(cè)試(DST)[2]。本文通過(guò)回顧性分析我院結(jié)核病區(qū)痰培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌分離情況及結(jié)核桿菌復(fù)合群者對(duì)8種抗結(jié)核藥物：異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、左氧氟沙星、卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸鈉、阿米卡星的藥物敏感性進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)我院結(jié)核病患者的結(jié)核菌分離情況及耐藥模式，以期對(duì)我院及我市的結(jié)核病防治提供臨床資料及用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2015年5月—2017年11月本院結(jié)核病區(qū)住院患者，痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌復(fù)合群陽(yáng)性169例患者納入研究范圍，其中男134例，女35例，年齡14～85歲。培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行菌株鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，所用納入研究的標(biāo)本全部為痰標(biāo)本，排除尿液、胸腹水、腦脊液等其他部位的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1痰液涂片鏡檢

患者按醫(yī)囑分別取深部痰液或肺部咳出痰液3份，即時(shí)、清晨、夜間痰液各1份，經(jīng)涂片進(jìn)行萋尼氏抗酸染色后顯微鏡鏡檢，抗酸染液試劑購(gòu)自珠江貝索生物技術(shù)有限公司，方法參照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行[3]。

1.2.2培養(yǎng)及藥敏

依據(jù)中國(guó)防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[4]要求，將經(jīng)4%NaOH處理后的痰標(biāo)本接種至酸性羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)陽(yáng)性病例中采用比例法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定(DST)[5]。我院藥敏試劑共9種，包括5種一線(xiàn)抗結(jié)核藥物：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、利福噴丁(REF)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(EMB)及4種二線(xiàn)抗結(jié)核藥物：左氧氟沙星(Lfx)、卷曲霉素(CPR)、阿米卡星(AMK)、對(duì)氨基水楊酸鈉(PAS)等。因利福平與利福噴丁藥理作用相同，以下對(duì)結(jié)核桿菌復(fù)合群統(tǒng)計(jì)耐藥性只計(jì)入利福平。酸性培養(yǎng)基及藥敏試劑均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 耐藥性判定

陽(yáng)性標(biāo)本的菌液接種于絕對(duì)濃度藥敏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，4周后觀察結(jié)果，最長(zhǎng)觀察6周。藥敏培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或菌落數(shù)少于20個(gè)，判定為敏感，菌落數(shù)大于20個(gè)，判定為耐藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌分離情況分析

我院2年間進(jìn)行結(jié)核桿菌培養(yǎng)的痰液標(biāo)本中培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本為184例，其中結(jié)核桿菌復(fù)合群陽(yáng)性為169例(91.85%)，非結(jié)核桿菌復(fù)合群15例(8.15%)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=257.783，P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。169例結(jié)核桿菌復(fù)合群痰涂片陽(yáng)性128例(75.74%)，15例非結(jié)核桿菌復(fù)合群痰涂片陽(yáng)性8例(53.33%)，兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.587，P=0.058)。

2.2 結(jié)核桿菌復(fù)合群患者一般請(qǐng)況分析

痰培養(yǎng)的標(biāo)本中培養(yǎng)結(jié)核桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的169例患者作為研究對(duì)象,按照臨床診斷分為初治和復(fù)治兩組,初次進(jìn)行抗結(jié)核治療的患者為初治組，重復(fù)治療的患者為復(fù)治組，初治患者127例,男98例，年齡15～83歲，女29例，年齡19～81歲，復(fù)治患者42例,男36例，年齡24～81，女6例，年齡31～74歲。初、復(fù)治患者在性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(因患者年齡呈偏態(tài)分布，以中位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 初復(fù)治兩組患者一般情況分析

2.3 藥敏情況分析

對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本用一線(xiàn)和二線(xiàn)共8種抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)， 169例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體，不耐藥為108例，占63.91%，耐藥為61例，占36.09%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=26.142，P=0.000。蕪湖地區(qū)臨床分離的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體雖然以敏感為主，但耐藥菌株所占比例較高。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體對(duì)8種抗結(jié)核藥物耐藥率存在明顯不同，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.225，P=0.000),耐藥率從高到低依次INF(20.71%)、S(15.98%)、RFP(14.79%)、Lfx(13.61%)、EMB(4.73%)、PAS(4.73%)、CRP(4.14%)、AMK(1.78%)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。15例非結(jié)核分枝桿菌結(jié)核群對(duì)8種抗結(jié)核藥物基本都耐藥。

表2 169例患者總體耐藥性分析

注：結(jié)核分枝桿菌對(duì)8種抗結(jié)核藥物耐藥率組間比較χ2=64.225，P=0.000。

2.4 初、復(fù)治患者對(duì)8種抗結(jié)核藥物的耐藥情況分析

根據(jù)患者治療情況分為初治和復(fù)治兩組，分別探討兩組患者對(duì)8種抗結(jié)核藥物的耐藥率。結(jié)果顯示復(fù)治患者除異煙肼(χ2=3.571，P=0.059)，對(duì)其他7種抗結(jié)核藥物的耐藥率均高于初治患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為24.077、6.605、6.373、4.946、4.077、6.373、9.235，P分別為0.000、0.010、0.012、0.026、0.043、0.012、0.002)，初治患者耐藥率排名前3藥物依次為異煙肼、鏈霉素、左氧氟沙星，復(fù)治患者耐藥率排名前3依次為利福平、異煙肼、鏈霉素，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 初、復(fù)治患者對(duì)8種結(jié)核藥物耐藥分析

2.5 調(diào)查對(duì)象耐藥類(lèi)型分析

耐藥類(lèi)型: 依據(jù)2006年《WHO耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南》[6]，分為5種類(lèi)型：?jiǎn)文退?對(duì)任意一種結(jié)核藥物耐藥)、耐多藥(對(duì)兩種最重要的一線(xiàn)藥物異煙肼和利福平耐藥)、多耐藥(除外異煙肼和利福平，對(duì)其他任意2種或以上抗結(jié)核藥物耐藥)、廣泛耐藥(XDR-TB：為耐多藥結(jié)核病，加上對(duì)二線(xiàn)注射藥物和氟喹諾酮的耐藥性)、全耐藥(對(duì)本室8種的抗結(jié)核藥物均耐藥)。對(duì)我院初、復(fù)治患者耐藥率類(lèi)型進(jìn)行比較顯示，我室初復(fù)治患者耐多藥率、廣泛耐藥率比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為6.339、8.391，P分別為0.012、0.004)，在單耐藥率、多耐藥率和全耐藥率上不存在顯著性差異(P均>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 初、復(fù)治結(jié)核患者耐藥類(lèi)型對(duì)比研究[n(%)]

3 討 論

結(jié)核病是當(dāng)今世界主要的傳染病之一。耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)，使得目前的治療策略變得無(wú)效，結(jié)核病控制變得越來(lái)越困難。這就需要藥物敏感性測(cè)試，而不是僅僅依賴(lài)于能夠識(shí)別結(jié)核桿菌的分子技術(shù)。世界衛(wèi)生組織建議以經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)患者的總體藥物敏感性試驗(yàn)(DST)模式進(jìn)行治療。一旦實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可用，世衛(wèi)組織建議根據(jù)DST結(jié)果進(jìn)行治療[7]。藥敏測(cè)試是確定耐藥性的關(guān)鍵，以藥敏試驗(yàn)為基礎(chǔ)的個(gè)體化藥物治療方案將有助于減少耐藥菌株的傳播。

2015年5月至 2017年11月間我院結(jié)核病區(qū)送檢痰標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)，共184例患者培養(yǎng)出菌落,經(jīng)最終菌型鑒定,其中結(jié)核桿菌復(fù)合群169例(91.85%),非結(jié)核分枝桿菌15例(8.15%),兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=257.783，P=0.000)，我院痰培養(yǎng)分離菌株以結(jié)核桿菌復(fù)合群為主(91.85%),占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與我院臨床診斷上相符，肺病患者中以肺結(jié)核患者為主。同時(shí)，我室檢測(cè)結(jié)果顯示，非結(jié)核分枝桿菌分離的比例也占到8.15%，提示臨床上可能存在較多的非結(jié)核分枝桿菌引起的肺病患者。我室資料顯示，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群患者與非結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽(yáng)性率不存在顯著性差異(χ2=3.587，P=0.058)，痰涂片陽(yáng)性，加上非結(jié)核分支桿菌肺病在臨床癥狀、各種輔助檢查以及影像資料特點(diǎn)等方面均與肺結(jié)核十分相似，無(wú)臨床特異性，同時(shí)臨床對(duì)非結(jié)核分枝桿菌肺部認(rèn)識(shí)上不足,可能會(huì)誤導(dǎo)醫(yī)生，引起誤診，我院經(jīng)DST測(cè)試，非結(jié)核分枝桿菌對(duì)8種抗結(jié)核藥物基本全耐藥，用抗結(jié)核藥物治療療效非常差，臨床需對(duì)遷延不愈、治療效果差的患者加強(qiáng)關(guān)注，加強(qiáng)痰分枝桿菌培養(yǎng)與菌種的鑒定[8]，以鑒別診斷患者是耐藥結(jié)核桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌引起的肺病。我室對(duì)痰培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本結(jié)核桿菌用一線(xiàn)和二線(xiàn)共8種抗結(jié)核藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，169例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體，不耐藥為108例，占63.91%，耐藥為61例，占36.09%，存在顯著性差異(χ2=26.142，P=0.000)，蕪湖地區(qū)臨床分離的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體仍以敏感為主，但耐藥菌株所占比例較高，高于沈艷[9]研究的31.6%，耐藥情況不容樂(lè)觀。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體對(duì)8種抗結(jié)核藥物耐藥率存在明顯不同，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.225，P=0.000)，8種抗結(jié)核藥物耐藥率從高到低依次INF(20.71%)、S(15.98%)、RFP(14.79%)、Lfx(13.61%)、EMB(4.73%)、PAS(4.73%)、CPR(4.14%)、AMK(1.78%)。蕪湖地區(qū)與劉延梅[10]的研究在耐藥順序上有所不同，提示不同地理區(qū)域結(jié)核耐藥情況可能不同[11]，需根據(jù)當(dāng)?shù)啬退幜餍胁W(xué)的基礎(chǔ)實(shí)施個(gè)體化結(jié)核病管理和治療。從我院目前耐藥情況來(lái)看，對(duì)異煙肼、鏈霉素、利福平耐藥率最高，與肺結(jié)核患者常規(guī)化療方案以異煙肼、利福平、鏈霉素的組合為主有關(guān)，在中國(guó)這樣的高結(jié)核病負(fù)擔(dān)國(guó)家，從臨床標(biāo)本中分離出分枝桿菌，并對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物進(jìn)行鑒定，以及抗結(jié)核藥物藥敏體外試驗(yàn)等程序，傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)方法緩慢而繁瑣，這使得適當(dāng)治療延遲成為必然，在此期間，患者可能受到不適當(dāng)?shù)闹委?，耐藥菌株可能繼續(xù)傳播，并可能發(fā)生擴(kuò)增耐藥性[12]。

我們發(fā)現(xiàn)二線(xiàn)藥物左氧氟沙星的耐藥率超過(guò)了一線(xiàn)藥物乙胺丁醇，同劉延梅研究相同[10]，提示一線(xiàn)藥物治療效果差，依靠經(jīng)驗(yàn)則改用二線(xiàn)藥物需要慎重，要考慮到本地區(qū)耐藥情況。對(duì)我院初、復(fù)治患者耐藥性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)治患者比初治患者更易產(chǎn)生耐藥性[13], 我室檢測(cè)顯示復(fù)治患者除了異煙肼，對(duì)其他7種藥物的耐藥率均高于初治患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初治患者耐藥前3名依次為異煙肼、鏈霉素、左氧氟沙星，復(fù)治患者耐藥前3名為利福平、異煙肼、鏈霉素，初、復(fù)治患者耐藥譜存在顯著不同，臨床需謹(jǐn)慎對(duì)待，為不同的患者選擇適宜的抗結(jié)核藥物。初、復(fù)治患者在耐多藥率、廣泛耐藥率存在顯著性差異(χ2分別為6.339、8.391，P分別為0.012、0.004)，這與相關(guān)研究一致[14]，結(jié)核病復(fù)治患者耐藥率增多與不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)核病治療、不規(guī)則用藥、使用傳統(tǒng)的DST引起結(jié)核治療的嚴(yán)重延誤等因素密切相關(guān)[15]。特別是復(fù)治組出現(xiàn)1例對(duì)8種藥物全耐藥菌株，復(fù)治患者出現(xiàn)相當(dāng)大比例的廣泛耐藥結(jié)核病例，廣泛耐藥結(jié)核日益增加的趨勢(shì)以及糟糕的治療結(jié)果，敲響了對(duì)廣泛耐藥結(jié)核的警報(bào)，警示必須加強(qiáng)對(duì)耐藥結(jié)核患者的有效治療和嚴(yán)格管理。

通過(guò)菌種鑒定及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)分析，蕪湖地區(qū)肺結(jié)核以結(jié)核桿菌復(fù)合群致病為主，同時(shí)伴有少量非結(jié)核桿菌復(fù)合群引起的肺病，本地區(qū)結(jié)核以敏感為主，耐藥結(jié)核的發(fā)生率較高，初、復(fù)治患者耐藥譜存在顯著不同，復(fù)治患者在耐多藥率、廣泛耐藥率皆顯著高于初治患者。通過(guò)分析，我們認(rèn)為在結(jié)核控制策略中，盡可能早的進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，由于常規(guī)培養(yǎng)和藥敏費(fèi)時(shí)過(guò)長(zhǎng)，不可避免出現(xiàn)藥敏結(jié)果延遲，對(duì)臨床治療缺乏指導(dǎo)性，應(yīng)擴(kuò)大快速診斷方法，并在患者管理和信息聯(lián)系方面進(jìn)行改進(jìn)，以減少治療延誤[16]。結(jié)核病控制方案需要將重點(diǎn)放在有效的政策上，必須在早期進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)、適當(dāng)?shù)慕Y(jié)核治療和有效的感染控制方面采取措施[2]，在每一個(gè)新診斷的藥物敏感結(jié)核病患者中合理使用藥物，以防止出現(xiàn)耐藥性。