超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定柑橘中甲基硫菌靈及其代謝物殘留

凌淑萍，葉時民，付巖，王全勝，張亮，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)屬蕓香科植物。我國是世界上柑橘生產(chǎn)第一大國，資源豐富，優(yōu)良品種繁多。浙江每年加工出口罐頭消耗鮮橘約25萬t，為浙江柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益與社會效益。柑橘果實適宜于全果資源化利用，柑橘果汁和橘瓣罐頭均是水果中第一大同類加工品[1]。2016年初，我國出口美國的柑橘罐頭被FDA檢出多菌靈超標而退貨，其中包括浙江的個別罐頭廠[2]。如再次查出多菌靈超標，對我國柑橘罐頭產(chǎn)業(yè)會造成不良影響。

甲基硫菌靈(甲基托布津)是一種廣譜性內(nèi)吸低毒殺菌劑，在柑橘中常用于防治瘡痂病和炭疽病等。甲基硫菌靈被植物吸收后，通過一系列的生化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為另一種苯并咪唑類殺菌劑多菌靈，通過干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細胞分裂，起到殺菌作用。多菌靈性質(zhì)穩(wěn)定，可通過葉片和種子滲入植物體內(nèi)，耐雨水沖洗，殘效期長。苯菌靈和多菌靈同屬于苯并咪唑類內(nèi)吸式殺菌劑。由于多菌靈對哺乳動物有一定的生殖毒性，在植物中殘留期較長，可通過食物鏈威脅人體健康[3]。苯菌靈的檢測方法是通過轉(zhuǎn)化成多菌靈，以多菌靈進行計算。對甲基硫菌靈殘留物定義為甲基硫菌靈、多菌靈和苯菌靈之和，以多菌靈表示。因此，在測定甲基硫菌靈的同時要測定多菌靈和苯菌靈。

目前，我國關(guān)于甲基硫菌靈、多菌靈和苯菌靈的檢測方法主要有高效液相法[4-5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀法[6-8]、氣相色譜法、薄層色譜法、免疫學方法和生物法[4]等。高效液相色譜法選擇性差，靈敏度不高；氣相色譜法樣本前處理復雜；薄層色譜法靈敏度低；免疫學方法如熒光免疫法操作比較復雜且易受干擾。薛霞等[9]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測定化妝品中苯菌靈和多菌靈。張志勇等[10]采用HPLC-MS/MS測定黃瓜和土壤中的甲基硫菌靈和多菌靈。但甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈3種藥物在柑橘中的殘留檢測報道較少。本文基于QuEChERS樣品前處理技術(shù)，研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定柑橘中甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈殘留量的檢測方法。該方法定量準確，靈敏度高，為有效監(jiān)控甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈在柑橘上的殘留風險提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS(Waters)，色譜柱Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，恒溫振蕩器(IKA KS4000ic)，高速離心機(Sigma 3K15)，高速勻漿機(IKA T25)，旋渦混合器(IKA GENIUS3)，烘箱(STIK BAO-112A)，離心管，電子天平，以及其他實驗室常用儀器設(shè)備等。

甲基硫菌靈、苯菌靈、多菌靈標準品純度分別為98.90%、98.00%、99.60%，均購自Dr.Ehrenstorfer；乙腈、乙酸銨為色譜純。

1.2 樣品前處理方法

稱取試驗(柑橘全果、果肉)樣品5.00 g，置于50 mL離心管中，加入15.0 mL乙腈，振蕩提取30 min后加入2 g氯化鈉劇烈震蕩1 min，再以9 500 r·min-1離心3 min，吸取上清液0.3 mL至另一試管中，并加入純水至1.0 mL，混合均勻，過0.22 μm濾膜后供LC-MS/MS測定。

1.3 標準溶液配制

標準儲備液配制。準確稱取10.13 mg甲基硫菌靈標準品于10.00 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容，混勻得到1 002 mg·L-1標準儲備液；準確稱取10.18 mg苯菌靈標準品于10.00 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容，混勻得到998 mg·L-1標準儲備液；準確稱取25.10 mg多菌靈標準品于10.00 mL容量瓶中，用乙腈與0.1 mol鹽酸(體積比為9∶1)混合溶液定容，混勻得到1 000 mg·L-1標準儲備液。

混合基質(zhì)標準工作液配制。將甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈分別用定溶液稀釋成濃度為100 mg·L-1的標準中間液。再用乙腈配制成濃度為10 mg·L-1混合標準工作液。以柑橘全果或果肉空白基質(zhì)液與純水(體積比為3∶7)作為稀釋液，將混合標準工作液梯度稀釋成1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005、0.001 mg·L-1不同濃度的基質(zhì)標準工作液。

1.4 儀器條件

色譜柱柱溫35 ℃，樣品室溫度15 ℃，進樣體積10.0 μL。流動相為5 mmol乙酸銨(A)和乙腈(B)，采用梯度淋洗，具體如表1。

表1 甲基硫菌靈、多菌靈和苯菌靈流動相梯度洗脫條件

電噴霧離子源，正離子掃描，多重反應(yīng)監(jiān)測，電離電壓2.5 kV，霧化氣流速1 000 L·h-1；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃。具體如表2。

表2 多重反應(yīng)監(jiān)測條件

注：*為定量離子。

由于苯菌靈在前處理過程中有一部分會轉(zhuǎn)化為多菌靈，因此，計算苯菌靈的回收率時，同時檢測苯菌靈和多菌靈，并折合成苯菌靈計算其回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準溶液曲線與靈敏度

將甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈標樣用柑橘空白樣品(基質(zhì))提取稀釋液成不同濃度的標準基質(zhì)工作溶液，按1.4節(jié)儀器條件下進樣檢測，甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈的保留時間分別為2.73、3.29、1.48 min左右，得到MS響應(yīng)值(峰面積，Y)與進樣濃度(X)的線性回歸方程。當甲基硫菌靈在柑橘全果基質(zhì)中進樣濃度為0.001～0.500 mg·L-1時，二者呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.997 7，Y=14 874 139X+213 647；當甲基硫菌靈在柑橘果肉基質(zhì)中進樣濃度為0.001～0.500 mg·L-1時，二者呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.995 7，Y=15 996 032X+281 618；當多菌靈在柑橘全果基質(zhì)中進樣濃度為0.001～0.500 mg·L-1時，二者呈線性關(guān)系，線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)r為0.995 0，Y=27 025 330X+541 145；當多菌靈在柑橘果肉基質(zhì)中進樣濃度為0.001～0.250 mg·L-1時，二者呈線性關(guān)系，線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)r為0.995 6，Y=39 147 025X+388 591；當苯菌靈在柑橘全果基質(zhì)中進樣濃度為0.001～0.500 mg·L-1時，二者呈線性關(guān)系，線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，Y=11 711 299X+1 252；當苯菌靈在柑橘果肉基質(zhì)中進樣濃度為0.001～0.500 mg·L-1時，二者呈線性關(guān)系，線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)r為0.996 7，Y=21 651 339X+303 727。在上述條件下，根據(jù)標準曲線最低濃度0.001 mg·L-1，進樣量10 μL計算，甲基硫菌靈、多菌靈和苯菌靈最小檢出量均為5.0×10-12g。

2.2 添加回收率與相對標準偏差

按上述色譜條件及檢測步驟，由表3～5可知，甲基硫菌靈在柑橘全果和柑橘果肉中的添加濃度為0.01～5.00 mg·kg-1，平均回收率為92%～104%和90%～95%，相對標準偏差最大值為7%；多菌靈在柑橘全果和柑橘果肉中的添加濃度為0.01～5.00 mg·kg-1，平均回收率為76%～85%和77%～100%，相對標準偏差最大值為6%；苯菌靈在柑橘全果和柑橘果肉中的添加濃度為0.05～5.00 mg·kg-1，平均回收率為77%～88%和86%～90%，相對標準偏差最大值為7%，符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》中的相關(guān)要求。

表3 柑橘果實甲基硫菌靈的添加回收率

表4 柑橘果實中多菌靈的添加回收率

表5 柑橘果實中苯菌靈的添加回收率

3 小結(jié)

本研究建立了一種同時測定甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈殘留分析方法：聯(lián)合應(yīng)用QuEChERS技術(shù)和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對柑橘中甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈進行殘留量測定。試驗結(jié)果表明，該方法前處理操作簡單，凈化效果好，精確度、準確度、檢出限和回收率等均符合農(nóng)藥殘留分析要求，為有效監(jiān)控柑橘中甲基硫菌靈、苯菌靈和多菌靈提供可靠的技術(shù)支持。