蔣 婧，任航行，李 杰，王高富，陳燦燦，付 琳，張 麗，劉良佳，周 鵬*

(1．重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2．重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

【研究意義】酉州烏羊目前僅分布于重慶市酉陽(yáng)縣，被當(dāng)?shù)厝朔Q為“藥羊”，是重慶市特有的優(yōu)良遺傳資源。該羊體格中小，除背脊線和兩眼圈為黑毛外，其余被毛均為白色，全身皮膚及眼、鼻、口、肛門、陰門等可視黏膜為烏色。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，100日齡酉州烏羊胎兒表皮和真皮組織中已含有較多黑色素顆粒，而同日齡渝東白山羊胎兒皮膚組織中則未檢測(cè)到，表明黑色素沉積是影響烏皮羊和非烏皮羊之間皮膚顏色差異的重要因素，而且在皮膚發(fā)育分化的早期，兩種羊黑色素細(xì)胞的遷移就可能存在差異[1]。皮膚表皮層的黑色素細(xì)胞，是由成黑素細(xì)胞分化而來(lái)，成黑素細(xì)胞則起源于神經(jīng)外胚層的神經(jīng)嵴細(xì)胞沿背側(cè)途徑遷移衍生[2]。黑色素由黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑色素小體產(chǎn)生，其形成受多條信號(hào)通路調(diào)控，在整個(gè)黑色素生成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，包含很多重要的調(diào)控基因，其中ASIP、END3和PAX3等基因位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，對(duì)位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游的酪氨酸酶家族基因(TYR、TYR1和DCT)具有一定的調(diào)控作用[3-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ASIP通過(guò)抑制下游基因的表達(dá)水平或酶活性來(lái)抑制黑色素的生成，過(guò)表達(dá)ASIP可抑制真黑色素的減少而產(chǎn)生褐黑色素[5-6]。PAX3被認(rèn)為在早期的神經(jīng)嵴和黑色素細(xì)胞的發(fā)育分化中扮演重要角色，可通過(guò)激活下游基因來(lái)調(diào)控黑色素細(xì)胞的存活、增殖、遷移和分化，此外還參與了色素合成的代謝過(guò)程[7-8]。END3能有效促進(jìn)成黑素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的存活、增殖、分化，以及調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的色素合成[4,9]。TYR是黑色素合成過(guò)程中的限速酶，其活性的高低直接影響真黑色素和褐黑色素的生成[10]，TYRP1和DCT(TYRP2)屬于TYR家族的成員，直接參與真黑色素合成[3,11]，它們的活性和表達(dá)受上游基因的調(diào)控?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，這6個(gè)與黑色素合成相關(guān)的重要基因是否在不同膚色山羊皮膚中存在表達(dá)差異、是否與山羊皮膚黑色素沉積有關(guān)尚不清楚。因此，本研究擬以酉州烏羊(白毛烏皮)、板角山羊(白毛白皮)和小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10)為研究對(duì)象，檢測(cè)ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT在成年烏皮與白皮羊皮膚組織、B16-F10增殖與分化階段的mRNA相對(duì)表達(dá)量，分別從體內(nèi)和體外檢測(cè)這6個(gè)基因的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析它們表達(dá)之間的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為進(jìn)一步闡明山羊皮膚黑色素沉積的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

成年酉州烏羊和板角山羊公羊(各3只)由重慶市酉州烏羊資源保護(hù)場(chǎng)提供，屠宰后采集皮膚組織，置于液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆?。B16-F10細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、馬血清(horse serum，HS)、青鏈霉素和0.25 %胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis和FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)均購(gòu)自德國(guó)Roche公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)

B16-F10細(xì)胞增殖培養(yǎng)：將液氮保存的B16-F10復(fù)蘇于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90 %時(shí)進(jìn)行傳代。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3遍；0.25 %胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、脫落時(shí)，10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化；1000 r/min，離心2 min，棄上清，加入10 mL含10 % FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，吹打均勻；接種到6孔板中，于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)基，分別于接種后1、3、5和7 d收集細(xì)胞。

B16細(xì)胞分化培養(yǎng)步驟：培養(yǎng)于在6孔板的B16細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞融合度約80 %左右時(shí)更換為含2 %馬血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，隔天更換一次培養(yǎng)基。分別在分化后1、3、5和7 d收集細(xì)胞。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

用Trizol法提取酉州烏羊和板角山羊皮膚組織、B16-F10細(xì)胞增殖與分化階段細(xì)胞的總RNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，核酸蛋白儀測(cè)量總RNA濃度。cDNA合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測(cè)ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT基因在不同膚色山羊皮膚組織和B16-F10細(xì)胞增殖與分化階段的mRNA表達(dá)情況。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，退火溫度退火60 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)基因重復(fù)3次。β-actin為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間方差分析和顯著性檢驗(yàn)利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；各基因表達(dá)的相關(guān)性利用雙變量Pearson檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，**表示差異(或相關(guān)性)極顯著(P<0.01)，*表示差異(或相關(guān)性)顯著(P<0.05)。

表1 基因引物參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 酉州烏羊與板角山羊皮膚黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)及相關(guān)性分析

qRT-PCR檢測(cè)了ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT基因在不同膚色山羊皮膚中的mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果(圖1)顯示，ASIP在酉州烏羊皮膚中的表達(dá)極顯著低于板角山羊(P<0.01)，TYRP1和DCT在酉州烏羊皮膚中的表達(dá)極顯著高于板角山羊(P<0.01)，PAX3、TYR在酉州烏羊皮膚中的表達(dá)顯著高于板角山羊(P<0.05)，EDN3在酉州烏羊皮膚中的表達(dá)略高于板角山羊，差異不顯著(P>0.05)。

如表2所示，ASIP與TYRP1和DCT呈極顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.01)。EDN3與ASIP、PAX3、TYR、TYRP1和DCT相關(guān)性均不顯著(P>0.05)。PAX3與TYR和TYRP1呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。TYRP1、TYR、DCT兩兩之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

2.2 黑色素合成相關(guān)基因在B16-F10細(xì)胞增殖階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)及相關(guān)性分析

如圖2所示，ASIP、TYRP1和DCT表達(dá)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在3 d極顯著高于1 d(P<0.01)；EDN3表達(dá)與ASIP和TYRP1相似，在7 d極顯著低于1 d(P<0.01)；PAX3與TYR表達(dá)模式相似，均在增殖階段后期高于前期，且在7 d極顯著高于1 d(P<0.01)。暗示它們?cè)谏丶?xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。

**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)** indicates the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05)

各基因在B16-F10細(xì)胞增殖階段表達(dá)的相關(guān)性(表3)顯示，ASIP與TYRP1和DCT均呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，與PAX3呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與EDN3呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；PAX3與TYRP1呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與TYR呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；TYRP1和DCT呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)；其它各基因間相互不顯著相關(guān)(P>0.05)。

表2 各基因在不同膚色山羊皮膚組織中的表達(dá)的相關(guān)系數(shù)

注：**表示2個(gè)基因表達(dá)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示2個(gè)基因表達(dá)呈顯著相關(guān)(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between two genes (P<0.05).

A～F分別表示ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1、DCT在B16-F10細(xì)胞增殖階段的mRNA相對(duì)表達(dá)量；與1 d相比，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)A-F indicated mRNA relative expression levels of ASIP, EDN3, PAX3, TYR, TYRP1 and DCT in the proliferation phase of B16-F10 cells; ** indicates the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05), compared with 1 day

2.3 各基因在B16-F10細(xì)胞分化階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)及相關(guān)性分析

各基因在B16-F10細(xì)胞分化階段的mRNA表達(dá)情況如圖3所示，ASIP與TYR和DCT具有相似的表達(dá)模式，均在3 d的相對(duì)表達(dá)量最高，其中TYR在3 d的相對(duì)表達(dá)量顯著高于1 d(P<0.05)，DCT則在后面3 d的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于1 d(P<0.01)，而ASIP在7 d的相對(duì)表達(dá)量顯著低于1 d(P<0.05)；PAX3和TYRP1表達(dá)在整個(gè)分化階段呈持續(xù)下降趨勢(shì)，均在5和7 d極顯著低于1 d(P<0.01)。

各基因在B16-F10細(xì)胞分化階段表達(dá)的相關(guān)性(表4)顯示，ASIP與TYRP1均呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，與TYR和DCT呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；PAX3與TYRP1呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與DCT呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；TYR與DCT呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，與TYRP1呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；其它各基因間相互不顯著相關(guān)(P>0.05)。

3 討 論

動(dòng)物毛色、膚色的形成主要取決于黑色素細(xì)胞中合成的真黑色素與褐黑色素的比例，真黑色素比例偏高時(shí)，表現(xiàn)出黑色或褐色，相反則表現(xiàn)出白色、黃色或紅棕色[12]。TYR正是控制這2種色素合成比例的限速酶，當(dāng)其活性高時(shí)，真黑色素合成比例偏高，反之褐黑色素偏高[12-13]。TYRP1和DCT有很高的同源性，促使真黑色素生成并使TYR的活性保持穩(wěn)定[14]。本研究檢測(cè)到TYR在酉州烏羊皮膚中的表達(dá)顯著高于板角山羊，TYRP1和DCT在酉州烏羊皮膚組織中的表達(dá)極顯著高于板角山羊，說(shuō)明TYR、TYRP1和DCT的高表達(dá)對(duì)酉州烏羊皮膚真黑色素沉積有促進(jìn)作用，前人在深色被毛和淺色被毛動(dòng)物上的研究也得到類似的結(jié)果[15-18]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ASIP基因在深色被毛個(gè)體中表達(dá)量低于白色被毛個(gè)體[19-20]，并推測(cè)是由于ASIP抑制TYRP1和DCT基因的表達(dá)和翻譯，顯著降低TYR的酶活性造成的。本研究發(fā)現(xiàn)成年酉州烏羊皮膚組織中的ASIP基因極顯著低于板角山羊，且與TYRP1和DCTmRNA表達(dá)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與前人研究結(jié)果相符，說(shuō)明ASIP可能通過(guò)間接調(diào)控TYRP1和DCTmRNA表達(dá)水平來(lái)抑制酉州烏羊皮膚的真黑色素沉積。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PAX3在酉州烏羊皮膚中表達(dá)顯著高于板角山羊，與TYR和TYRP1的mRNA表達(dá)極顯著正相關(guān)，暗示PAX3高表達(dá)與酉州烏羊皮膚真黑色素沉積表型密切相關(guān)。

表3 各基因在B16-F10細(xì)胞增殖階段表達(dá)的相關(guān)系數(shù)

注：**表示2個(gè)基因mRNA表達(dá)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示2個(gè)基因mRNA表達(dá)呈顯著相關(guān)(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between mRNA expression of two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between mRNA expression of two genes (P<0.05).

A～F分別表示ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1、DCT在B16-F10細(xì)胞分化階段的mRNA相對(duì)表達(dá)量；與1 d相比，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)A-F indicated mRNA relative expression levels of ASIP, EDN3, PAX3, TYR, TYRP1 and DCT in the differentiation phase of B16-F10 cells; ** indicate the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05), compared with 1 day

表4 各基因在B16-F10細(xì)胞分化階段mRNA表達(dá)的相關(guān)系數(shù)r

注：**表示兩個(gè)基因表達(dá)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示兩個(gè)基因表達(dá)呈顯著相關(guān)(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between two genes (P<0.05).

酪氨酸酶基因家族(TYR)包括TYR與TYRP1、DCT3個(gè)基因，其中TYRP1、DCT基因均來(lái)源于TYR基因的自我復(fù)制和變異，雖然它們的外顯子個(gè)數(shù)不一樣，但它們編碼的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，且均在黑色素生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11, 21]。黑素小體是生成黑色素的細(xì)胞器，在其發(fā)育前期，黑色素還未生成時(shí)，TYR酶活性較高，隨著黑色素的慢慢沉積，TYR酶活性逐漸降低，當(dāng)黑素小體完全充滿了黑色素時(shí)，TYR酶活性也完全失去[22]。本研究在B16-F10細(xì)胞增殖階段，檢測(cè)到TYRmRNA表達(dá)隨著增殖時(shí)間的增加而增加，在細(xì)胞分化前期，TYRmRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)，到分化3 d，其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，隨后下降，在分化7 d達(dá)到一個(gè)較低值。說(shuō)明B16-F10細(xì)胞在增殖階段，只是細(xì)胞數(shù)量上在發(fā)生變化，而未生成黑色素；在分化階段前期，大量黑素小體處于發(fā)育前期，到分化階段后期，隨著黑色素顆粒的增多，越來(lái)越多的黑素小體進(jìn)入發(fā)育后期，TYR的表達(dá)及活性也隨之降低。TYRP1和DCT分別與TYRmRNA表達(dá)在B16-F10細(xì)胞分化階段呈顯著和極顯著正相關(guān)，但在增殖階段相關(guān)性不顯著，說(shuō)明TYRP1和DCT只在黑色素生成過(guò)程中對(duì)維持TYR活性的穩(wěn)定具有一定的功能，這與TYRP1和DCT只參與真黑色素生物合成的理論相符。本研究檢測(cè)到PAX3表達(dá)在B10-F10細(xì)胞增殖階段后期極顯著高于前期，說(shuō)明PAX3確實(shí)在早期黑色素細(xì)胞發(fā)育中扮演重要的角色。而隨著B(niǎo)10-F10細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)間的增加，PAX3基因表達(dá)呈持續(xù)降低的趨勢(shì)，說(shuō)明PAX3參與了色素合成的代謝過(guò)程，且與前人認(rèn)為PAX3表達(dá)顯著下調(diào)是B16細(xì)胞分化并產(chǎn)生黑色素的重要前提條件相符[1]。

綜上所述，TYR直接參與山羊皮膚和B16-F10細(xì)胞真黑色素的合成過(guò)程，其高表達(dá)能促進(jìn)真黑色素的生成，影響酉州烏羊皮膚黑色素沉積。TYRP1和DCT只在真黑色素合成過(guò)程對(duì)維持TYR表達(dá)有作用，從而間接對(duì)酉州烏羊皮膚黑色素沉積具有促進(jìn)作用。ASIP對(duì)TYRP1和DCT表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，低表達(dá)ASIP促進(jìn)了酉州烏羊皮膚黑色素的沉積。PAX3表達(dá)顯著下調(diào)是黑色素瘤細(xì)胞分化并產(chǎn)生黑色素重要前提條件，但其高表達(dá)能促進(jìn)黑色素細(xì)胞的發(fā)育與增殖，所以在酉州烏羊皮膚中，PAX3可能通過(guò)促進(jìn)黑色素細(xì)胞數(shù)量的增多來(lái)促進(jìn)黑色素的沉積。本研究結(jié)果還暗示，EDN3可能不是導(dǎo)致板角山羊與酉州烏羊皮膚黑色素沉積差異的關(guān)鍵基因。這些研究結(jié)果為將來(lái)進(jìn)一步闡明酉州烏羊皮膚黑色素沉積的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。但黑色素生成過(guò)程太過(guò)復(fù)雜，現(xiàn)在的研究還只是冰山一角，是否還存在其他通路的調(diào)控尚未清楚，且每個(gè)基因是否還參與調(diào)控其他性狀的信號(hào)通路也不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

TYR、TYRP1和DCT基因高表達(dá)能促進(jìn)真黑色素的生成，影響酉州烏羊皮膚黑色素沉積。PAX3可能通過(guò)促進(jìn)黑色素細(xì)胞數(shù)量的增多來(lái)促進(jìn)皮膚黑色素的沉積。ASIP對(duì)TYRP1和DCT表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，低表達(dá)ASIP促進(jìn)了酉州烏羊皮膚黑色素的沉積。EDN3可能不是導(dǎo)致板角山羊與酉州烏羊皮膚黑色素沉積差異的關(guān)鍵基因。