人工繁殖齊口裂腹魚胚胎及仔魚發(fā)育觀察

張建明，姜 偉

(1.中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100；2.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443100)

【研究意義】齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)，屬鯉形目，鯉科，裂腹魚亞科，裂腹魚屬，裂腹魚亞屬。俗稱雅魚、齊口、細甲魚、齊口細鱗魚，主要分布于長江上游、金沙江、岷江、大渡河等水系，底層魚類，要求較低的水溫環(huán)境，喜歡生活于急緩流交界處，有短距離生殖洄游現(xiàn)象；以著生藻類為食，偶爾亦食一些水生昆蟲、螺螄和植物的種子[1]。20世紀70年代，雅安周公河盛產(chǎn)雅魚，但20世紀90年代以后，由于捕撈不合理、自然生態(tài)遭到破壞，致使大批齊口裂腹魚受傷、死亡，造成產(chǎn)量急劇下降，許多河段無齊口裂腹魚的蹤影。2000年8月四川省政府把雅魚作為重點保護動物，并設(shè)立禁魚區(qū)[2]?！厩叭搜芯窟M展】目前，對齊口裂腹魚的研究大多數(shù)集中在急性毒性、繁殖生物學(xué)、苗種培育等方面[3-5]，關(guān)于齊口裂腹魚胚胎發(fā)育及仔魚發(fā)育的研究報道鮮見?！颈狙芯壳腥朦c】本文對齊口裂腹魚胚胎發(fā)育及1～30日齡仔魚發(fā)育特征進行了觀察研究，旨在了解齊口裂腹魚胚胎及仔魚早期發(fā)育特點，【擬解決的關(guān)鍵問題】為齊口裂腹魚的人工繁育積累基礎(chǔ)資料，并為齊口裂腹魚人工增殖中的規(guī)模化繁育提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

試驗于2018年3-4月在中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所云南烏東德實驗站進行。親魚為人工養(yǎng)殖4齡以上齊口裂腹魚親魚，親魚養(yǎng)殖于10 m×10 m的方形水泥池內(nèi)，水深1.5 m，山泉水流水養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫6～20 ℃。用于繁殖的齊口裂腹魚雌魚體重1.6～2.8 kg，雄魚體重0.8～1.5 kg，體質(zhì)健康無傷病。雌魚采用LHRH-A2+HCG激素兩針法注射催產(chǎn)，流水刺激誘導(dǎo)產(chǎn)卵；雄魚采用LHRH-A2一針法注射催產(chǎn)采精，使用干法進行人工授精，試驗期間胚胎發(fā)育水溫為14.1～16.8 ℃，仔魚生長水溫為15.5～19.6 ℃，溶氧量>6 mg/L。選取發(fā)育質(zhì)量好的一批受精卵進行胚胎發(fā)育觀察研究。利用解剖鏡觀察受精卵發(fā)育各時期，每次觀察受精卵數(shù)量大于10粒，以70 %的受精卵進入相同發(fā)育時期作為一個發(fā)育期的判定，并詳細進行記錄。采用10 %福爾馬林溶液固定受精卵用于材料復(fù)核，典型發(fā)育時期進行卵膜剝離觀察并拍照。

選取同批次受精卵發(fā)育出膜的仔魚用于仔魚發(fā)育觀察研究，每次選取至少5尾仔魚，采用10 %福爾馬林溶液固定，在鏡下進行觀察并記錄發(fā)育特征，在出膜后1～30日齡內(nèi)，每天進行觀察并做詳細記錄。采用10 % 福爾馬林溶液固定部分材料，典型發(fā)育時期進行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎發(fā)育階段觀察研究

2.1.1 受精卵 成熟的卵呈淡黃色，色澤鮮明，卵為沉性，卵徑2.8～3.1 mm。受精約5～6 min后卵出現(xiàn)粘性，此時受精卵易粘連在一起，將卵放置在孵化篩中，約1～2 h后粘性減弱，此時用羽毛輕輕攪動，黏連的卵粒便會分離。受精后1～1.5 h受精卵吸水膨脹到最大，卵徑約為3.9～4.1 mm，卵周隙較大，卵膜透明，可清晰的看到卵膜內(nèi)的胚胎，動物極部分隆起形成胚盤(圖1：1a)。

2.1.2 卵裂階段 受精后約4～5 h，隆起的胚盤表面開始出現(xiàn)分裂溝。分裂溝逐漸加深將胚盤表面分為兩部分，此時受精卵進入2細胞期。之后可觀察到胚盤表面開始出現(xiàn)垂直于第一次分裂溝的另一分裂溝，此時受精卵進入4細胞期。進入16細胞期之后，胚盤表面分裂的細胞呈不規(guī)則排列，大小也不均勻。隨著分裂的進行，受精卵進入多細胞期，分裂細胞的細胞團差異進一步變大(圖1：1b)。

2.1.3 囊胚階段 受精后約11～12 h，隨著分裂的進行，細胞團明顯隆起，在鏡下可明顯的觀察到黃、白相間的界限，分裂的細胞團隆起更明顯。之后隨著細胞分裂進行，胚盤逐漸變矮，此時為典型的囊胚期(圖1：2a-2b)。

2.1.4 原腸胚階段 受精后約18～20 h，囊胚細胞開始向植物極下包，鏡下觀察可見胚盤黃、白相間的邊緣部分隆起明顯，隨后胚盾出現(xiàn)，即中胚層細胞內(nèi)卷開始出現(xiàn)，受精卵發(fā)育進入典型的原腸胚階段，整個原腸胚發(fā)育階段較為緩慢，用時較長(圖1：3a-3b)。

2.1.5 神經(jīng)胚階段 受精后約39～40 h，分裂細胞下包到卵黃部分的大部，神經(jīng)板內(nèi)陷形成溝狀，隨后胚孔封閉，神經(jīng)溝開始閉合，胚體前端膨大隆起，腦泡開始形成，最后，整個胚體呈馬蹄形狀俯臥在卵黃囊上(圖1：4)。

2.1.6 器官形成階段 受精后47～50 h，胚體發(fā)育進入器官形成期，最早可觀察到腦泡兩側(cè)眼囊輪廓的形成，之后隨著發(fā)育的進行，體節(jié)出現(xiàn)且數(shù)量逐漸增多，受精75 h之后可觀察到腦泡后側(cè)出現(xiàn)聽囊輪廓。在受精后85～88 h，可明顯的觀察到尾芽形成，之后可見尾鰭褶的出現(xiàn)。受精后約110～115 h，可觀察到胚體開始在細胞膜內(nèi)偶有扭動，最初胚體的扭動具有間歇性，之后隨著發(fā)育時間的延長，扭動次數(shù)增多(圖1：5a-9b)。

2.1.7 出膜階段 受精后約140 h，開始進入出膜期，出膜之前胚體在卵膜內(nèi)劇烈運動，可以觀察到胚體劇烈扭動、翻轉(zhuǎn)，此時卵膜逐漸變軟、變薄，出膜過程表現(xiàn)為尾部或頭部沖破卵膜，之后胚體劇烈扭動撕破卵膜，最后整個胚體出膜。初孵的仔魚全長約9～10 mm，鏡下觀察仔魚通體透明，體節(jié)明顯，卵黃上可見血管分布，剛出膜的仔魚靜臥水底，偶有掙扎性運動(圖1：10～11)。

1、受精卵； 2a、囊胚期(帶卵膜)；2b、囊胚期(去膜卵膜)；3a、原腸期(帶卵膜)；3b、原腸期(去膜卵膜)；4、神經(jīng)胚期；5a、聽囊出現(xiàn)期(帶卵膜)；5b、聽囊出現(xiàn)期(去膜卵膜)；6a、尾芽出現(xiàn)期(帶卵膜)；6b、尾芽出現(xiàn)期(去膜卵膜)；7a、尾鰭褶形成期(帶卵膜)；7b、尾鰭褶形成期(去膜卵膜)；8a、心搏期(帶卵膜)；8b、心搏期(去膜卵膜)；9a、胚動期(帶卵膜)；9b、胚動期(去膜卵膜)；10、出膜期；11、初孵魚苗

2.2 仔魚發(fā)育階段觀察研究

出膜后第1天，仔魚全長約9～10 mm，通體透明，體節(jié)明顯；卵黃囊前部呈球形或橢球型，后部呈圓柱形或棒狀，上有血管分布；眼廓明顯，有少量色素沉積；魚苗靜臥水底，偶有掙扎性游動(圖2：1)。

出膜后第2天，仔魚全長約10～11 mm，仔魚卵黃囊前部球狀部分略有減小，后部棒狀部分增大，分布血管增多；眼部色素沉積增多，已呈現(xiàn)黑色；胸鰭部位可見小的凸起，即胸鰭芽開始出現(xiàn)；可觀察到鰓部組織輪廓；血細胞增多，觀察到心臟部位呈淡紅色。魚苗的掙扎性運動增強(圖2A：2)。

出膜后第3天，仔魚全長約11.0～11.5 mm，眼大且明顯突出，眼睛完全呈黑色，眼球銀光層明顯；胸鰭增大。魚苗運動能力增強，在水中做向上性的掙扎運動(圖2A：3)。

出膜后第4天，仔魚全長約11.5～12.0 mm，卵黃囊進一步變??；臀鰭、背鰭部位出現(xiàn)小的凸起，表明臀鰭、背鰭開始生長；口裂明顯；頭部、背部開始零星出現(xiàn)色素沉積。仔魚的掙扎性運動能力增強(圖2A：4)。

出膜后第5天，仔魚全長約12.0～12.7 mm，卵黃囊持續(xù)變小，胸鰭進一步增大，可在水底自由運動；鰓蓋張合運動明顯；頭部、背部色素沉積增多。仔魚在池底出現(xiàn)聚集、扎推現(xiàn)象(圖2A：5a～5b)。

出膜后第6～7天，仔魚全長約12.5～13.5 mm，卵黃囊持續(xù)變小，頭部、背部色素沉積持續(xù)增多，心臟搏動明顯；部分仔魚鰾出現(xiàn)，鰾1室。部分仔魚開始分散于水中游動(圖2A：6～7)。

1、出膜第1天；2、出膜第2天；3、出膜第3天；4、出膜第4天；5a、出膜第5天；5b、出膜第5天(俯視)；6、出膜第6天；7、出膜第7天；8a、出膜第8天；8b、出膜第8天(俯視)；9a、出膜第9天；9b、出膜第9天(俯視)；10a、出膜第10天；10b、出膜第10天(俯視)；11a、出膜第11天；11b、出膜第11天(俯視)；12a、出膜第12天；12b、出膜第12天(俯視)；13a、出膜第13天；13b、出膜第13天(俯視)；14a、出膜第14天；14b、出膜第14天(俯視)；15a、出膜第15天；15b、出膜第15天(俯視)

16a、出膜第16天；16b、出膜第16天(俯視)；17a、出膜第17天；17b、出膜第17天(俯視)；18a、出膜第18天；18b、出膜第18天(俯視)；19a、出膜第19天；19b、出膜第19天(俯視)；20a、出膜第20天；20b、出膜第20天(俯視)；21a、出膜第21天；21b、出膜第21天(俯視)；22a、出膜第22天；22b、出膜第22天(俯視)；23a、出膜第23天；23b、出膜第23天(俯視)；24a、出膜第24天；24b、出膜第24天(俯視)；25a、出膜第25天；25b、出膜第25天(俯視)；26a、出膜第26天；26b、出膜第26天(俯視)；27a、出膜第27天；27b、出膜第27天(俯視)；28、出膜第28天；29、出膜第29天；30、出膜第30天

出膜后第8～9天，仔魚全長約13.5～14.5 mm，在卵黃囊和軀體之間可見明顯的魚鰾已充氣；同時在卵黃囊和軀體之間的軀體內(nèi)壁可見色素沉積，形成一條色素帶，尾鰭色素沉積明顯。仔魚游動能力進一步增強，大部分仔魚游到水面進入平游期，仔魚游動時成群現(xiàn)象明顯(圖2A：8a～9b)。

出膜后第10～11天，仔魚全長約14.0～15.0 mm，尾鰭色素沉積增多，尾鰭條輪廓明顯；背鰭變大明顯。仔魚開始攝食浮游動、植物(圖2A：10a～11b)。

出膜后第12～13天，仔魚全長約15.0～15.5 mm，已經(jīng)可以觀察到明顯的腸道系統(tǒng)，攝食后可以明顯的觀察到食物在腸道內(nèi)形成一條暗色的線狀；軀體內(nèi)部中間部位的色素帶顏色加深(圖2A：12a～13b)。

出膜后第14～15天，仔魚全長約15.0～15.7 mm，卵黃囊進一步縮小呈細棒狀，部分仔魚開始進入鰾2室階段。仔魚攝食旺盛(圖2A：14a～15b)。

出膜后第16～21天，仔魚全長約15.5～17.0 mm，卵黃囊吸收殆盡，各部分組織進一步生長明顯增大；尾鰭條、背鰭條形成；尾鰭上、下葉進一步分化；16日齡全部仔魚進入鰾2室階段；仔魚腹部開始生長膨大。仔魚完全攝食外源性營養(yǎng)物質(zhì)，主要攝食浮游動、植物(圖2B：16a～21b)。

出膜后第22～25天，仔魚全長約17.0～18.0 mm，體高、體寬明顯增大，體色分布均勻，鰭條明顯，肌節(jié)清晰，攝食后腹部膨大明顯；部分仔魚開始攝食微粒子配合飼料，仔魚攝食量增加(圖2B：22a～25b)。

出膜后第26～30天，仔魚全長約18.0～19.0 mm，仔魚胸鰭、背鰭、尾鰭、臀鰭等形態(tài)結(jié)構(gòu)生長明顯已趨于完善，腸道結(jié)構(gòu)明顯，腹部進一步膨大，體高增長明顯，多數(shù)仔魚開始大量攝食微粒子配合飼料，生長迅速(圖2B：26a～30)。

3 討 論

3.1 齊口裂腹魚胚胎發(fā)育特點

齊口裂腹魚胚胎發(fā)育過程與大多數(shù)淡水硬骨魚類基本相同[6-9]，屬于盤狀卵裂類型，胚胎發(fā)育先后經(jīng)歷了胚盤形成、卵裂、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期等過程，其發(fā)育過程基本遵循了淡水硬骨魚類胚胎發(fā)育的一般規(guī)律[10]。本研究觀察到齊口裂腹魚成熟卵卵徑在2.8～3.1 mm，與常見的淡水鯉科魚類相比，其卵徑要大，如四川裂腹魚(Schizothoraxkozlovi)成熟卵卵徑2.0～2.8 mm[11]、松潘裸鯉(Gymnocyprispotanini)成熟卵卵徑2.7～2.9 mm[8]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)成熟卵卵徑(1.18±0.09) mm[6]。潘曉賦[12]的研究表明，卵徑大小對魚類的早期發(fā)育和存活具有重要的意義，通常卵徑較大的魚類能夠保證在仔魚開口前為仔魚的發(fā)育和器官的形成提供充足的營養(yǎng)和能量，保證仔魚具有更高的存活潛力，因此，按照該研究結(jié)論，齊口裂腹魚仔魚具有較強的生存潛力。本研究觀察到齊口裂腹魚有些胚胎發(fā)育階段的歷時與吳青[13]的報道有差別，這可能是胚胎孵化水溫、孵化過程中水溫波動以及親魚來源等因素不同造成的。在本研究的觀察中也發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚胚胎發(fā)育各階段的耗時不同，其中器官形成期耗時最長，表明器官形成期是整個胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵時期，在孵化過程中要加強這個階段的孵化管理，如提供充足的溶氧、保證良好的水質(zhì)、控制適宜的溫度，以保證孵化效果。裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育用時也存在差異，如本研究中齊口裂腹魚胚胎發(fā)育在水溫14.1～16.8℃下用時約140 h，四川裂腹魚胚胎發(fā)育在水溫11.0～21.0℃下用時約102 h[11]，短須裂腹魚(Schizothoraxwangchiachii)胚胎發(fā)育在水溫12.7～14.0℃下用時約192.5 h[14]，花斑裸鯉(GymnocypriseckloniHerzensten)胚胎發(fā)育在水溫14.0～16.0℃下用時約118.5 h[15]，松潘裸鯉胚胎發(fā)育在水溫10.2～23.4℃下用時約150 h[8]，對比其它裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育用時，齊口裂腹魚胚胎發(fā)育用時長于四川裂腹魚和花斑裸鯉，短于短須裂腹魚和松潘裸鯉，這可能是孵化水溫和品種不同的原因。

3.2 齊口裂腹魚仔魚發(fā)育特點

本研究觀察到齊口裂腹魚初孵仔魚出膜后與裂腹魚亞科中四川裂腹魚、短須裂腹魚、松潘裸鯉等魚類仔魚各器官組織差異較小、發(fā)育過程相似[8,11,14]。本研究顯示齊口裂腹魚初孵仔魚全長約9～10 mm，裂腹魚亞科中四川裂腹魚初孵仔魚全長約為7.8～8.5 mm[11]、短須裂腹魚初孵仔魚全長約為(10.88±0.41) mm[14]、松潘裸鯉初孵仔魚全長約為8 mm[8]、花斑裸鯉初孵仔魚全長約為7.6～8.0 mm[15]，對比可知，齊口裂腹魚初孵仔魚全長大于四川裂腹魚、松潘裸鯉和花斑裸鯉，而與短須裂腹魚相近，表明齊口裂腹魚初孵仔魚在裂腹魚亞科中屬于較大的類型。在齊口裂腹魚仔魚發(fā)育觀察中發(fā)現(xiàn)，仔魚出膜16 d后卵黃囊才開始消耗殆盡，而符鵬[16]等的研究結(jié)果顯示白烏鱧(Opniocepnalusargus)孵化出膜后第3天卵黃囊就消耗完，邵建春[17]研究顯示翹嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)孵化出膜后4日齡時黃囊消殆盡。因此，與一般淡水硬骨魚類相比，齊口裂腹魚仔魚卵黃囊在仔魚發(fā)育過程中存在時間較長，這可能是由于齊口裂腹魚仔魚發(fā)育過程中需要更多的內(nèi)源性營養(yǎng)造成的，關(guān)于齊口裂腹魚卵黃在仔魚發(fā)育過程中的作用及消耗機制有待進一步研究。同時，在本研究中觀察到仔魚出膜后第10～11天，可以開口攝食浮游動、植物，在仔魚出膜后22 d，部分仔魚可以攝食微粒子配合飼料，出膜后26 d，多數(shù)仔魚開始大量攝食微粒子配合飼料且攝食旺盛，這對齊口裂腹魚仔魚早期培育具有指導(dǎo)和借鑒作用。