于 娟 紀(jì)海玉 白 云 孫蘇軍 劉安軍
(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457)
茶是世界上最受大眾歡迎的飲品之一,由茶樹的芽葉經(jīng)過(guò)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等典型工藝精制而成[1]。根據(jù)制造工藝中發(fā)酵程度不同,又可將茶分為綠茶(未發(fā)酵)、烏龍茶(半發(fā)酵)、普洱茶(后發(fā)酵茶)和紅茶(全發(fā)酵)[2]。紅茶中富含多種益于身體健康的抗氧化多酚,如兒茶素、茶黃素和茶紅素等[3],具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn),紅茶多酚不僅在體外表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除活性氧自由基的能力[4-5],還可通過(guò)保持抗氧化酶的活性來(lái)抑制自由基的生成[6-7],從而達(dá)到抗衰老、減肥的效果。
惡性腫瘤治愈困難,致死率高,是一類危害人類健康的重大疾病[8-9]?;熓悄壳搬槍?duì)癌癥的主要治療手段,臨床通常采用患者可以耐受的最大藥物劑量,然而需延長(zhǎng)治療周期之間的時(shí)間間隔,且常會(huì)產(chǎn)生具有藥物抗性的癌細(xì)胞,從而導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)[10-11]。近年來(lái)提高機(jī)體抗腫瘤免疫能力成為研究熱點(diǎn),通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用清除腫瘤細(xì)胞不僅無(wú)毒副作用,而且可產(chǎn)生持久的免疫記憶,有效防止腫瘤復(fù)發(fā)[12]。另外,腫瘤的發(fā)生常伴隨著自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷,惡化患者的病情[13],一些具有抗氧化作用的藥物也被用于腫瘤的治療[14]。
目前對(duì)紅茶多酚的研究主要集中在其對(duì)肥胖、衰老小鼠的抗氧化活性以及體外清除自由基作用上,而對(duì)其體內(nèi)抗腫瘤活性研究較少。本文構(gòu)建了腫瘤動(dòng)物模型,研究紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
紅茶:坦洋工夫紅茶,產(chǎn)地福建福安。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/c小鼠40只,雌性,體質(zhì)量19~21 g,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部,SCXK(京)2011-0012。
試劑:MTT,美國(guó) Sigma 公司;DMSO,北京索萊寶科技有限公司;FITC-CD3、FITC-CD8、PECD19、PE-CD4單克隆抗體,天津三箭生物有限公司;小鼠IL-2試劑盒、小鼠TNF-α試劑盒、小鼠IFN-γ試劑盒,上海滬峰生化試劑有限公司;SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒,南京建成生物工程研究所;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。
Multiskan Ascent全自動(dòng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Rad公司;FACSCaliber流式細(xì)胞儀,美國(guó)Becton Dicknson公司;ST16R冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo公司。
1.3.1 紅茶多酚的提取工藝 稱取一定量冷凍干燥后的紅茶放入燒杯,加入70%乙醇常溫浸提1.5 h,抽濾,收集濾液,將殘?jiān)酝瑯拥姆椒ㄔ俳?次,合并濾液,減壓濃縮,冷凍干燥后得到紅茶多酚粗提物。
采用福林酚法[15]進(jìn)行測(cè)定,以沒食子酸作對(duì)照,計(jì)算得出紅茶多酚提取物中多酚含量為23.62%,之后采用大孔樹脂進(jìn)行純化,其多酚含量可達(dá)68.24%。
1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,分別為空白組[10 mL/(kg·d)生理鹽水]、模型組[10 mL/(kg·d)生理鹽水]、紅茶多酚低劑量組[250 mg/(kg·d)]、紅茶多酚高劑量組[500 mg/(kg·d)],每組10只,灌胃14d后,在除空白組以外的各組小鼠右腋下接種H22腫瘤細(xì)胞(2×106細(xì)胞/只),然后繼續(xù)灌胃21 d。
1.3.3 生理指標(biāo)采集 實(shí)驗(yàn)期結(jié)束,對(duì)小鼠末次灌胃后,斷糧12 h,然后斷頸處死,解剖取小鼠脾臟、胸腺及腫瘤并稱重,計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率[16-17]。
1.3.4 脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè) 取各組小鼠脾臟,研磨后用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/mL,以100 μL/well加入到96孔培養(yǎng)板中,向?qū)嶒?yàn)孔分別加入100 μL/well ConA和LPS(終質(zhì)量濃度為5 μg/mL),對(duì)照孔添加相同體積的培養(yǎng)基,置于5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)44 h[18],通過(guò)MTT法讀取570 nm處吸光值檢測(cè)細(xì)胞活性,計(jì)算ConA和LPS對(duì)脾細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)得到脾T淋巴細(xì)胞(ConA)和B淋巴細(xì)胞(LPS)增殖能力。
1.3.5 脾NK細(xì)胞活性 用1640培養(yǎng)基將小鼠脾細(xì)胞懸液調(diào)整成濃度為2×106細(xì)胞/mL,將H22細(xì)胞濃度調(diào)整成1×105細(xì)胞/mL。實(shí)驗(yàn)孔加效應(yīng)細(xì)胞(脾單個(gè)核細(xì)胞)和靶細(xì)胞(H22細(xì)胞)各100 μL/well,效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加效應(yīng)細(xì)胞和RPMI1640培養(yǎng)基各100 μL/well,靶細(xì)胞對(duì)照孔加靶細(xì)胞和RPMI1640 培養(yǎng)基各 100 μL/well,于 37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,通過(guò)MTT法測(cè)定脾NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[18]。
1.3.6 巨噬細(xì)胞吞噬活性檢測(cè) 將各組小鼠腹腔細(xì)胞取出并調(diào)整濃度至1×106細(xì)胞/mL,以100 μL/well接入96孔板中,置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,每孔加入750 μg/mL中性紅溶液100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,用生理鹽水將過(guò)量的中性紅洗干凈,加入100 μL細(xì)胞裂解液(乙醇∶乙酸=1∶1,體積比),混勻后 4℃放置過(guò)夜,酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)下的讀數(shù)大小可反映出腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力[18]。
1.3.7 外周血淋巴細(xì)胞亞群比例檢測(cè) 取100 μL各組小鼠外周血并分成2組,均加入2 μL肝素鈉溶液(5 mg/mL)抗凝,然后分別加FITC-CD3+抗體和PE-CD19+抗體、PE-CD4+抗體和FITCCD8+抗體各 2 μL,暗處孵育 30 min,除去紅細(xì)胞和未結(jié)合的抗體后重懸于0.5 mL的PBS溶液中,最后通過(guò)FCM測(cè)定小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群水平[18]。
1.3.8 細(xì)胞因子檢測(cè) 各組小鼠血清的IL-2、IFN-γ、TNF-α水平檢測(cè)均按照試劑盒說(shuō)明書上的方法進(jìn)行。
1.3.9 抗氧化能力檢測(cè) 各組小鼠肝臟組織勻漿的SOD、GSH-Px活力和MDA含量測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)表示,組間均值比較采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水平為P<0.05時(shí)為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[19]。
各組小鼠適應(yīng)環(huán)境一周后,開始灌胃給藥,灌胃14 d后接種H22腫瘤細(xì)胞,之后又連續(xù)灌胃21 d。由表1可知,灌胃不同劑量的紅茶多酚均未影響各組小鼠的體質(zhì)量,未見明顯的消瘦現(xiàn)象及由于藥物引起的病變及中毒現(xiàn)象[20],說(shuō)明紅茶多酚對(duì)小鼠無(wú)不良影響,而后期由于實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)導(dǎo)致荷瘤小鼠體質(zhì)量偏大。
脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)是反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能最基本也是最常規(guī)的指標(biāo),已被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)機(jī)體的整體免疫狀態(tài)[18,21]。實(shí)驗(yàn)期結(jié)束后,將荷瘤小鼠斷頸處死并解剖,稱取各組小鼠的脾臟、胸腺和實(shí)體腫瘤,計(jì)算得出相應(yīng)的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和抑瘤率,如表1所示。與空白組相比,模型組小鼠的脾臟明顯腫大(P<0.05),胸腺嚴(yán)重萎縮(P<0.05),而灌胃多酚組小鼠的臟器指數(shù)較模型組均有明顯改善,更接近正常組。結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞的惡性增殖嚴(yán)重?fù)p害了模型組小鼠的免疫系統(tǒng);而紅茶多酚可顯著抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖,有效地保護(hù)了小鼠的脾臟和胸腺,且呈劑量相關(guān)性,高劑量組(500 mg/kg)小鼠的抑瘤率可達(dá)63.32%。
表1 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠免疫器官及腫瘤的作用(±s,n=10)Table1 Effects of black tea polyphenols on tumor-bearing mice(±s,n=10)
表1 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠免疫器官及腫瘤的作用(±s,n=10)Table1 Effects of black tea polyphenols on tumor-bearing mice(±s,n=10)
注:*與空白組比較P<0.05;# 與模型組比較P<0.05。
組別 初始體質(zhì)量/g 最終體質(zhì)量/g 脾臟指數(shù)/mg·g-1 胸腺指數(shù)/mg·g-1 瘤重/g 抑瘤率/%空白組19.51±0.27 21.12±0.23 5.116±0.628 1.916±0.066 - -模型組19.52±0.13 21.79±0.22* 9.679±0.922* 1.010±0.282* 2.157±0.217 -低劑量組19.41±0.19 21.49±0.25 7.298±0.402# 1.650±0.048# 1.159±0.217# 46.04高劑量組19.51±0.26 21.37±0.27# 6.269±0.476# 1.886±0.053# 0.791±0.183# 63.32
結(jié)果如表2所示,模型組小鼠的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)與空白組相比顯著降低(P<0.05),而不同劑量的紅茶多酚均可顯著增強(qiáng)荷瘤小鼠的T細(xì)胞(ConA)和B 細(xì)胞(LPS)的增殖活性(P<0.05),更接近空白組,并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。結(jié)果表明,由于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,導(dǎo)致機(jī)體脾臟腫大且細(xì)胞活性降低,而紅茶多酚能夠有效增強(qiáng)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性,從而提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力。
表2 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s,n=10)Table2 Effects of black tea polyphenols on splenocyte proliferation in tumor-bearing mice(±s,n=10)
表2 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s,n=10)Table2 Effects of black tea polyphenols on splenocyte proliferation in tumor-bearing mice(±s,n=10)
注:*與空白組比較P<0.05;# 與模型組比較P<0.05。
組別 ConA(SI)LPS(SI)空白組1.270±0.002 1.183±0.042模型組0.854±0.028* 0.737±0.02*低劑量組1.098±0.09# 0.939±0.038# 高劑量組1.240±0.04# 1.246±0.016#
如圖1所示,模型組小鼠的脾NK細(xì)胞殺傷能力與空白組小鼠相比顯著降低(P<0.05),而與模型組相比,紅茶多酚高劑量組可顯著提高荷瘤小鼠的脾NK細(xì)胞的殺傷能力(P<0.05),而低劑量組雖然也可在一定程度上提高其NK細(xì)胞活性,但較模型組無(wú)顯著差異。結(jié)果顯示,模型組小鼠由于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,NK細(xì)胞活性受到了抑制,致使其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷百分率較空白組小鼠大幅度降低,而多酚可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性,抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖,提高機(jī)體的免疫力。
從圖2可以看出,模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力較空白組顯著降低(P<0.05),而紅茶多酚可顯著增強(qiáng)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力(P<0.05),且呈劑量相關(guān)性。結(jié)果表明,紅茶多酚能夠顯著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性,增強(qiáng)機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞的能力,提高機(jī)體免疫水平。
圖1 紅茶多酚對(duì)H22荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞活性的影響(±s,n=10)Fig.1 Effects of black tea polyphenols on the activity of splenic NK cells in H22-bearing mice(±s,n=10)
由表3可見,體內(nèi)H22腫瘤細(xì)胞的惡性增殖導(dǎo)致模型組小鼠外周血的淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例比空白組小鼠顯著降低(P<0.05),而多酚高劑量組小鼠的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例較模型組小鼠均有回升(P<0.05),更接近于空白組小鼠。表明紅茶多酚可提高荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞的比例,增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞的識(shí)別能力和CD8+T細(xì)胞的殺傷作用,有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。
圖2 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(±s,n=10)Fig.2 Effects of black tea polyphenols on phagocytosis of peritoneal macrophage cells in tumor-bearing mice(±s,n=10)
不同處理對(duì)小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影響見表4。模型組小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平顯著低于空白組(P<0.05),說(shuō)明造模成功,而不同劑量的紅茶多酚均可提高荷瘤小鼠血清中 IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平(P<0.05)。說(shuō)明紅茶多酚可提高荷瘤小鼠體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子水平,增強(qiáng)機(jī)體直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
表3 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響(±s,n=10)Table3 Effects of black tea polyphenols on lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing mice(±s,n=10)
表3 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響(±s,n=10)Table3 Effects of black tea polyphenols on lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing mice(±s,n=10)
注:*與空白組比較P<0.05;# 與模型組比較P<0.05。
組別 CD3+ T細(xì)胞/% CD19+ B細(xì)胞/% CD4+ T細(xì)胞/% CD8+ T細(xì)胞/%空白組62.79±1.96 26.93±4.33 55.49±8.52 12.82±2.44模型組49.71±1.62* 37.24±5.04* 41.98±3.02* 9.96±1.70*低劑量組51.55±1.65 33.00±3.76 42.575±0.04 11.58±3.84高劑量組58.34±2.49# 30.71±4.70# 46.93±2.00# 14.86±1.88#
表4 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影響(±s,n=10)Table4 Effects of black tea polyphenols on the levels of IL-2,IFN-γ and TNF-α in serum of mice(±s,n=10)
表4 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影響(±s,n=10)Table4 Effects of black tea polyphenols on the levels of IL-2,IFN-γ and TNF-α in serum of mice(±s,n=10)
注:*與空白組比較P<0.05;# 與模型組比較P<0.05。
組別 IL-2/pg·mL-1 IFN-γ/pg·mL-1 TNF-α/pg·mL-1 空白組400.72±9.01 148.11±1.29 55.32±0.67模型組341.42±6.05* 127.01±1.94* 33.29±0.58*低劑量組355.68±4.61# 134.98±3.05# 41.55±3.24# 高劑量組381.47±7.59# 144.54±1.11# 50.36±1.83#
不同處理對(duì)小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響見表5。由表5可知,模型組小鼠肝臟組織的SOD、GSH-Px活力顯著低于空白組(P<0.05),而MDA含量顯著高于空白組(P<0.05),說(shuō)明造模成功。多酚低劑量組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力較模型組顯著升高(P<0.05),MDA含量雖略有降低,但較模型組無(wú)顯著差異;多酚高劑量組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力較模型組均顯著升高(P<0.05),而MDA含量較模型組顯著下降(P<0.05)。
表5 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響(±s,n=10)Table5 Effects of black tea polyphenols on the activities of SOD,GSH-Px and the contents of MDA in liver of mice(±s,n=10)
表5 紅茶多酚對(duì)荷瘤小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響(±s,n=10)Table5 Effects of black tea polyphenols on the activities of SOD,GSH-Px and the contents of MDA in liver of mice(±s,n=10)
注:*與空白組比較P<0.05;# 與模型組比較P<0.05。
組別 SOD 活力/U·mg-1 GSH-Px活力/U·mg-1 MDA 含量/nmol·mg-1 空白組139.42±1.97 270.81±3.16 8.36±2.71模型組114.86±3.34* 218.65±2.42* 11.11±4.91*低劑量組138.92±9.37# 266.14±9.11# 9.75±3.35高劑量組145.19±6.15# 278.41±8.30# 7.66±2.92#
近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤作用是通過(guò)非特異性免疫和特異性免疫共同實(shí)現(xiàn)的[19]。脾臟和胸腺作為機(jī)體重要的免疫器官,在抗腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用,NK細(xì)胞可直接殺傷腫瘤細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞則可清除被機(jī)體攻擊后暴露出抗原的腫瘤細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中,紅茶多酚不僅安全無(wú)毒,且可有效保護(hù)荷瘤小鼠的脾臟和胸腺,高劑量組(500 mg/kg)小鼠抑瘤率可達(dá)63.32%,同時(shí)顯著增強(qiáng)了荷瘤小鼠脾臟T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)、NK 細(xì)胞的殺傷活性(P<0.05)以及巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P<0.05),從而提高機(jī)體整體免疫能力。
在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中,CD4+T細(xì)胞不僅參與特異性抗體的生成,同時(shí)也在CD8+T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞和形成記憶細(xì)胞過(guò)程中行使輔助功能,而CD8+T細(xì)胞則主要負(fù)責(zé)攻擊腫瘤細(xì)胞[22]。IL-2主要參與T細(xì)胞的增殖分化和抗體的生成[23],IFN-γ在機(jī)體識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24],而TNF-α則是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性的細(xì)胞因子[25]。本試驗(yàn)中,紅茶多酚可顯著提高荷瘤小鼠外周血中T細(xì)胞的比例(P<0.05),且可顯著提高血清中 IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平(P<0.05),從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力,抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。
腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生大量的自由基,為自身的發(fā)展?fàn)I造高氧化環(huán)境[26]。SOD是體內(nèi)一種能夠有效清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶,可降低MDA及自由基代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,而GSH-Px是機(jī)體內(nèi)一種可特異性地催化GSH還原過(guò)氧化物反應(yīng)的重要的抗氧化酶,MDA是機(jī)體內(nèi)自由基引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的一種產(chǎn)物,常被作為評(píng)價(jià)機(jī)體氧化水平的一種指標(biāo)[27-28]。在本試驗(yàn)中,紅茶多酚可顯著提高荷瘤小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力(P<0.05),降低MDA含量,呈劑量相關(guān)性。表明紅茶多酚能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,減少機(jī)體自由基含量,有效保護(hù)機(jī)體重要組織不受損害。
試驗(yàn)結(jié)果表明,紅茶多酚可有效保護(hù)荷瘤小鼠的脾臟和胸腺,并顯著增強(qiáng)其脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力、NK細(xì)胞的殺傷活性和巨噬細(xì)胞的吞噬能力,且可提高外周血中T細(xì)胞的比例和血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平,增強(qiáng)肝臟組織中的SOD和GSH-Px的活力,降低MDA含量。綜上所述,紅茶多酚具有良好的抗腫瘤作用,其機(jī)制可能與其增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān),研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)和利用紅茶提供參考。