不同滾揉腌制對鴨肉蛋白及水分分布的影響

李 鵬 孫京新* 馮 婷 王淑玲 黃 明 徐幸蓮 周興虎

（1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109

2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心 南京 210095

3 南京農(nóng)大肉類食品有限公司 南京 210095）

腌制是貯藏肉制品最古老的方法之一。隨著肉制品加工技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對肉的腌制有了新的認(rèn)識，腌制除了能夠延長肉的貯藏期外，其對肉制品的加工工藝和產(chǎn)品特征有重要作用，比如提高肉的保水性、凝膠性以及改善肉的色澤、增加肉的香味等[1]。食鹽用于肉品腌制，其主要作用之一就是促進肌肉組織中的鹽溶性蛋白質(zhì)的溶出，這些蛋白的溶出能夠增加肌肉顆粒的黏合作用，提高乳化性和保水性，降低蒸煮損失，從而提高最終產(chǎn)品的品質(zhì)特性[2]。然而，如果腌制過程中沒有能夠促進食鹽快速滲透的有效手段，就會造成食鹽滲透緩慢，腌制時間過長等一系列問題，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)，甚至導(dǎo)致肌肉腐敗變質(zhì)，因此探索理想、高效的腌制工藝，受到越來越多的學(xué)者和生產(chǎn)者的關(guān)注[3-4]。

滾揉是一種動態(tài)腌制工藝，其通過較強的機械力作用造成肌肉纖維斷裂和肌細胞物理性損傷，同時促進食鹽等腌制液的滲透，并能減少腌制過程中細胞內(nèi)水分的損失，降低蒸煮損失，提高產(chǎn)品嫩度，目前已被廣泛應(yīng)用于肉制品的生產(chǎn)中[5]。實際生產(chǎn)中應(yīng)用較成熟的滾揉工藝是真空滾揉，其能夠提高腌制效率，改善原料肉的原有組織結(jié)構(gòu)、性能，使之具有良好的加工特性。謝媚等[6]研究發(fā)現(xiàn)，利用真空滾揉技術(shù)能夠改善鵝肉的嫩度，以及對鵝肉蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生影響，并且重度的真空滾揉效果更加顯著。楊秋麗等[7]在臘板鵝的加工過程中，發(fā)現(xiàn)通過真空滾揉能夠提高組織蛋白酶B（Cathepsin B）、鈣激活酶（Calpain）和細胞凋亡酶-3（Caspase-3）的活力，加速蛋白質(zhì)降解，縮短腌制周期，改善產(chǎn)品亮度。然而，在較長時間的真空滾揉腌制過程中，由于機械作用，肉塊溫度極易升高，從而導(dǎo)致微生物繁殖及肌肉熱變性，因此需將產(chǎn)品在2～4℃下滾揉；此外，真空滾揉過程中真空度的控制也是關(guān)鍵因素，否則會導(dǎo)致肌肉過度失水，降低產(chǎn)品品質(zhì)[8]。變壓滾揉是指在滾揉過程中將真空滾揉和常壓或加壓滾揉交替進行，使肉塊處于適當(dāng)壓迫和疏張交替作用中，從而造成肉塊所受壓力呈不斷的周期性變化，腌制液也經(jīng)歷吸入和擠出的交替運動過程。詹文圓等[9]在滾揉機里通入CO2和N2調(diào)整滾揉壓力，對豬肉進行滾揉腌制處理，發(fā)現(xiàn)其腌制效率和抑菌效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的真空滾揉腌制；然而加壓滾揉對于滾揉設(shè)備的材料和使用條件要求嚴(yán)格，在實際操作中存在不便。超聲波技術(shù)可以通過空穴作用，對肌肉組織起到嫩化作用，目前作為一種新興的高效、環(huán)保、非侵入性的加工技術(shù)，在肉品加工領(lǐng)域開展了一些研究，并取得良好的效果[3]。Jayasooriy等[10]對生鮮雞肉進行超聲波處理，發(fā)現(xiàn)超聲波能增強肌原纖維的斷裂程度，并導(dǎo)致其剪切力顯著下降。在超聲波與滾揉技術(shù)結(jié)合對雞肉[11]、鴨肉[12]腌制的研究中發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助滾揉能夠加速雞肉、鴨肉的腌制速率，提高腌制液吸收率，并且對于其色澤、嫩度、熟肉率、質(zhì)構(gòu)等食用品質(zhì)均有明顯改善。

目前國內(nèi)外有關(guān)滾揉腌制工藝的研究較多，超聲波技術(shù)在肉品加工領(lǐng)域也受到越來越多的關(guān)注，然而，在實際應(yīng)用中，長時間真空滾揉以及超聲波技術(shù)都容易產(chǎn)生熱量，使原料溫度升高，從而導(dǎo)致微生物生長與產(chǎn)品品質(zhì)劣變[9，13]。適用于工廠連續(xù)生產(chǎn)的滾揉與超聲波結(jié)合的技術(shù)、設(shè)備的研究和應(yīng)用還未見報道。本研究從解決傳統(tǒng)真空滾揉腌制時間長，加壓滾揉要求高，超聲波易產(chǎn)熱等問題出發(fā)，擬利用超聲波技術(shù)結(jié)合真空與常壓滾揉交替腌制處理，幫助滾揉腌制的呼吸以及熱量及時排出，通過測定不同腌制方法對鴨肉蛋白質(zhì)和水分改變，研究超聲輔助變壓滾揉對腌制過程中肌肉的品質(zhì)影響及作用機理，從而為研究新的肉品加工技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新希望六和鴨胸肉，當(dāng)?shù)卮笮统?；食鹽、復(fù)合磷酸鹽、抗壞血酸鈉、亞硝酸鈉均為食品級；聚乙烯自封袋，佛山市超盛包裝材料有限公司；高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，天根生化科技（北京）有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS），迪申生物技術(shù)（上海）有限公司；考馬斯亮藍、EDTA、氫氧化鈉等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GR-20型真空滾揉機，諸城新得利食品機械公司；JY92-IID超聲波乳化機，寧波新芝有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司、電子數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；梅特勒ML104T電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；Labram HR800拉曼光譜儀，法國Horiba Jobin Yvon公司；PQ001核磁共振分析儀，蘇州紐邁分析儀器有限公司；海爾BCD-216SDN冰箱，青島海爾有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 腌制液的配制 腌制液的配方參考馮婷等[13]方法，溶液配制完成經(jīng)充分溶解，置于0～4℃冷藏備用。

1.3.2 肉樣的處理 將冷凍鴨胸肉解凍，修整成大約5 cm×5 cm×2 cm、質(zhì)量50 g樣品，浸漬于裝有腌制液（料液比 1∶2，g/mL）的自封袋中，分成兩組，分別進行如下處理：

真空滾揉腌制（Vacuum tumbling，VT）：滾揉參數(shù)參考馮婷等[11]和Patra scu 等[14]方法，略作修改，真空度為0.08 MPa，溫度0～4℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。隨機挑選分裝好的樣品15份，將其放入滾揉機中，采用單向連續(xù)真空滾揉方式分別處理20，40，60，80，100 min，同時取 3 份未進行滾揉處理（0 min）的作為對照組，每個時間點隨機取出3份樣品分析（即為3個重復(fù)）。

超聲波輔助變壓滾揉腌制（Pressure-transform tumbling curing assisted by ultrasound，PTU）：參考馮婷等[11]方法，略作修改。隨機挑選分裝好的樣品15份，將所有樣品先放入超聲波細胞破碎儀（40 kHz，140 W）中處理 2 min，然后將其置于真空滾揉機（真空度0.08 MPa）單向連續(xù)滾揉9 min，然后去掉真空恢復(fù)常壓狀態(tài)，再單向連續(xù)滾揉9 min，從而完成一個PTU處理周期；再重復(fù)上述滾揉周期1，2，3，4次，同時每個滾揉周期取出3份樣品，由此可以分別得到經(jīng)過PTU處理時間為20，40，60，80，100 min的鴨肉樣品。未進行超聲波和滾揉處理（0 min）的原料鴨胸肉為對照。

真空與常壓交替的變壓滾揉腌制處理試驗本研究室前期已完成，結(jié)果顯示經(jīng)過相同處理時間其與真空滾揉相比腌制效果差異不顯著（數(shù)據(jù)還未發(fā)表）。在長時間滾揉過程中，采用變壓技術(shù)能夠通過氣體交換，有效降低原料溫度，因此本文采用超聲波輔助變壓滾揉技術(shù)與傳統(tǒng)真空滾揉進行比較研究。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 分別取不同滾揉方式、不同處理時間的鴨肉樣品各2 g，參考Siró等[3]的方法提取鴨肉組織的肌原纖維蛋白，進行SDS-PAGE電泳分析。電泳條件：采用丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠、丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，分子質(zhì)量范圍在10.0～200.0 u的高分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。濃縮膠中采用電壓80 V，進入分離膠后電壓120 V。

1.3.4 拉曼光譜分析 用于拉曼光譜分析的鴨肉肌原纖維蛋白提取及預(yù)處理方法參考謝媚等[6]的研究方法，分別對經(jīng)過真空滾揉和超聲波輔助變壓滾揉處理100 min的樣品進行處理，將得到的肌原纖維蛋白溶液稀釋，質(zhì)量濃度為40 μg/mL，置于4℃冰箱備用。拉曼光譜分析參考Xu等[15]的方法，采用Labram HR 800激光拉曼分析儀（帶514.5 nm氬離子激光）進行測試，每個樣品測定3次。根據(jù)苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)在1 003 cm-1伸縮振動強度作為內(nèi)標(biāo)進行歸一化，采用自帶Labspec軟件對圖譜進行基線校正和平滑處理，同時指認(rèn)肽鍵骨架振動和氨基酸側(cè)鏈光譜條帶[16]。參考Alix等[17]的方法，計算不同處理下鴨肉蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量的變化。

1.3.5 水分分析 參考 Han等[18]和李鵬等[19]方法，采用LF-NMR技術(shù)分析不同滾揉處理鴨肉中水分狀態(tài)變化。橫向弛豫時間（T2）在臺式脈沖NMR PQ001分析儀上測量，測量溫度設(shè)為32℃，質(zhì)子共振頻率為22.6 MHz。將0.5 g的樣品放入直徑12 mm的玻璃樣品管中，再將其放入直徑15 mm的核磁管中進行分析；弛豫時間T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill（CPMG）序列進行測量。

1.3.6 統(tǒng)計分析 本研究每個試驗進行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPASS 19.0進行顯著性分析，P<0.05時差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 滾揉處理對鴨肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳的影響

肌原纖維蛋白是一類具有重要生物學(xué)功能特性的結(jié)構(gòu)蛋白，占全蛋白總量的50%～55%，對肉制品的保水性、黏結(jié)性、彈性、熱誘導(dǎo)凝膠等有重要影響，能夠決定最終產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、產(chǎn)量等[18]。由圖1可見，不同滾揉腌制處理導(dǎo)致鴨肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳條帶發(fā)生明顯變化。其中，隨著滾揉時間的延長，代表較大分子質(zhì)量的肌球蛋白重鏈（MHC）、肌間線蛋白/結(jié)蛋白（Desmin）、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白條帶逐漸減弱，而分子質(zhì)量較小的蛋白條帶，如肌球蛋白輕鏈（MLC1和MLC2）、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C等電泳條帶明顯增強。產(chǎn)生這個現(xiàn)象的原因主要是在滾揉過程，肌肉組織受到摔打、碰撞、擠壓作用使得肌細胞膜和肌纖維發(fā)生破裂；此外，經(jīng)過滾揉使肌細胞中的一些內(nèi)源性蛋白酶得到更大釋放，從而作用于肌原纖維蛋白，加速蛋白質(zhì)的降解。同時比較這兩種滾揉處理，可以看出，相同的處理時間，PTU處理組的肌原纖維蛋白的變化趨勢更為明顯，說明PTU處理能夠加速腌制過程鴨肉蛋白的降解速率。原因可能是超聲波的力學(xué)效應(yīng)強化了細胞內(nèi)外的質(zhì)量傳輸，迅速破壞了肌膜結(jié)構(gòu)，使得更多的蛋白及內(nèi)源性蛋白酶在短時間內(nèi)溶出，提高了蛋白酶的活性，增加酶促反應(yīng)速率[20]；此外，由于變壓滾揉過程中真空滾揉和常壓滾揉交替進行能夠造成肉塊所受的壓力不斷發(fā)生無規(guī)則變化，使得細胞內(nèi)外的滲透平衡不易建立，促使?jié)B透-溶出作用可以持續(xù)進行，從而加速了蛋白的溶出和降解[9]。

2.2 滾揉處理對鴨肉蛋白拉曼光譜的影響

圖1 不同滾揉腌制處理的鴨肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of myofibrillar proteins in duck after treated by different tumbling curing treatment

鴨肉中含量最高的蛋白質(zhì)是肌原纖維蛋白，其在鴨肉加工過程中容易發(fā)生降解，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響鴨肉的品質(zhì)特性和理化特性[21]。Wang等[22]利用拉曼光譜技術(shù)對不同待宰靜養(yǎng)的雞肉蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)不同宰前靜養(yǎng)措施能夠引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，α-螺旋和β-折疊含量呈顯著差異，從而影響雞肉的品質(zhì)特性。周昌瑜等[23]通過拉曼光譜對不同熱處理的鴨肉肌原纖維蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)熱處理導(dǎo)致肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，從而對鴨肉風(fēng)味產(chǎn)生影響。本研究對不同滾揉腌制處理的鴨肉蛋白進行拉曼光譜檢測，通過與謝媚等[6]和李鵬等[19]研究結(jié)果進行比對分析，不同滾揉處理鴨肉的拉曼光譜如圖2所示，蛋白質(zhì)拉曼光譜譜帶的指認(rèn)如表1所示。

酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）是反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要譜帶[6，23]，α-螺旋結(jié)構(gòu)特征峰主要集中在1 645～1 657 cm-1范圍內(nèi)；β-折疊結(jié)構(gòu)特征峰主要在1 665～1 680 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)主要在1 680 cm-1附近；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)主要在1 660～1 665 cm-1附近[18，24]。 本研究對鴨肉進行不同滾揉腌制處理，對處理后鴨肉肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成及含量進行分析，結(jié)果如表2所示，可以看出滾揉處理對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的相對含量產(chǎn)生顯著影響（P<0.05）。未經(jīng)滾揉的鴨肉中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高，可達75.79%，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相對較低；經(jīng)過真空滾揉和超聲波輔助變壓滾揉處理100 min后，α-螺旋結(jié)構(gòu)分別降至39.09%和21.75%，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量顯著增大（P<0.05），其中超聲波輔助變壓滾揉樣品各結(jié)構(gòu)含量變化最大，該結(jié)果表明滾揉處理能夠引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。原因可能是超聲波輔助變壓滾揉通過物理破壞和超聲的空化效應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞或者部分α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為其它結(jié)構(gòu)，從而影響鴨肉的相關(guān)加工特性[6，19]。

圖2 不同滾揉處理后鴨肉蛋白的拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of duck’s muscle treated by tumbling curing

表1 鴨肉蛋白質(zhì)拉曼光譜條帶指認(rèn)Table1 Assignment of bands in the Raman spectra of duck muscle

表2 滾揉處理對鴨肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響（%）Table2 The effect of tumbling treatment on relative changes in the secondary structure content of duck’s muscle proteins tumbling treatment（%）

2.3 不同滾揉腌制處理對鴨肉水分狀態(tài)的影響

2.3.1 對鴨肉橫向弛豫時間T2的影響 圖3為經(jīng)過不同滾揉腌制處理鴨肉中水分狀態(tài)變化的弛豫圖譜，可見，在1～1 000 ms的弛豫時間內(nèi)有4個峰，其橫向弛豫時間分別為T20（0.1～1.5 ms），T21（2～10 ms），T22（10～100 ms），T23（100～1 000 ms），分別代表結(jié)合水、中度結(jié)合水、不易流動水和自由水[24-25]，該結(jié)果與李春等[26]用LF-NMR研究不同冷卻條件下豬肉水分分布的結(jié)果基本一致。同時由表3可知，滾揉后 T20顯著降低（P＜0.05），而兩種滾揉處理間 T20，T21差異不顯著（P＞0.05），即表明兩種滾揉方式對鴨肉結(jié)合水的影響不顯著；兩種滾揉處理導(dǎo)致T22顯著增加（P＜0.05），同時PTU處理導(dǎo)致 T23顯著降低（P＜0.05）。 T21和T22的下降說明PTU處理能降低肌肉中水分自由度，增強中度結(jié)合水和不易流動水與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力；原因可能是滾揉處理導(dǎo)致肌原纖維蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化，從而增強肌肉的保水性。張駿龍[27]在研究淀粉對肉糜保水性時也發(fā)現(xiàn)，隨著淀粉含量的增加，弛豫時間T21、T22呈逐漸下降的趨勢，從而有助于提高肉糜體系中不易流動水與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，使肉糜體系變得更為緊密牢固，原因可能是由于淀粉對肉糜的凝膠性造成影響。T23代表肌肉中的自由水群，PTU后下降為231 ms，顯著高于對照和VT處理組（P＜0.05），而對照和VT處理組之間無顯著差異，其變化趨勢可能與滾揉對肌漿蛋白的變性有關(guān)[28]。

圖3 不同滾揉處理鴨肉的弛豫時間T2圖譜Fig.3 The transverse relaxation time T2plot of duck muscle by different tumbling treatment

2.3.2 滾揉對鴨肉橫向弛豫時間T2峰面積的影響 肉和肉制品中橫向弛豫時間T2的大小可以反映水分的自由度，T2時間越長水分的自由度越高；此外，不同弛豫時間 T20，T21，T22和T23所相對應(yīng)的峰面積比P20，P21，P22和P23分別代表4種不同狀態(tài)水分的相對含量，通過相對含量的變化可以反映肉中不同狀態(tài)水分的相互轉(zhuǎn)化情況，從而表征肉的保水性變化[29]。表4所示為不同滾揉處理后鴨肉樣品的橫向弛豫時間T2所對應(yīng)峰面積P20，P21，P22和P23變化情況，經(jīng)PTU處理的鴨肉P21和P22增加最大（P＜0.05），同時 P23降低幅度最大（P＜0.05）。有研究表明，P21和P22與肌肉的保水性呈正相關(guān)，P23與保水性呈負相關(guān)[30]，這與本研究結(jié)果相一致。這可能是一方面由于滾揉破壞了肌肉細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致更多的鹽溶性蛋白溶出，提高保水性；另一方面超聲波的空化作用能夠引起肌原纖維溶脹以及鹽溶性蛋白的溶出，提高肌肉的吸水能力，從而增加肌細胞內(nèi)水分含量[31]。

表3 滾揉處理對鴨肉中不同狀態(tài)水分的弛豫時間的影響Table3 The effect of tumbling treatment on relaxation time for water of duck’s muscle

表4 滾揉處理對鴨肉中不同水分弛豫時間T2峰面積的影響Table4 The effect of tumbling treatment on the peak areas for different water of duck’s muscles

3 結(jié)論

本研究利用超聲波輔助變壓滾揉技術(shù)對鴨肉進行腌制處理，發(fā)現(xiàn)較真空滾揉腌制，超聲波輔助變壓滾揉能夠加速肌原纖維蛋白的降解，加速腌制速率，改善產(chǎn)品品質(zhì)。超聲波輔助變壓滾揉能夠改變肌肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，減少α-螺旋結(jié)構(gòu)，增加了β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；超聲波輔助變壓滾揉也提高了鴨肉中橫向弛豫時間T21和T22，以及所對應(yīng)的峰面積P21和P22，有助于提高肌肉的保水性，改善產(chǎn)品加工特性。