良惡性肺結(jié)節(jié)影像組學(xué)特征與分子標(biāo)記物相關(guān)性研究

康書(shū)朝，丁忠祥，崔 鳳，馮 琪，王 玫，牛家玲，王羅羽

(1.杭州市中醫(yī)院 放射科，浙江 杭州 310007； 2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 放射科， 浙江 杭州 310006)

腫瘤的分子生物學(xué)行為決定了病灶的病理形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)也是不同影像學(xué)特征的基礎(chǔ)?；蛲蛔兗跋嚓P(guān)蛋白表達(dá)與影像學(xué)特征關(guān)聯(lián)性的研究將影像學(xué)研究范圍拓展到微觀的分子領(lǐng)域[1-2]。隨著分子靶向治療的深入研究，尤其是針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變的酪氨酸激酶抑制劑的出現(xiàn)，肺癌中EGFR突變陽(yáng)性患者的總生存期超過(guò)2年[3]。EGFR是酪氨酸激酶活性的細(xì)胞膜受體，主要與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成、抑制凋亡及藥物抵抗有關(guān)[4]。EGFR敏感突變被確定為預(yù)測(cè)EGFR療效最可靠的生物標(biāo)志[5]。Ki-67抗原與腫瘤關(guān)系的研究表明[6]，Ki-67在腫瘤組織中含量越多，腫瘤細(xì)胞增殖越活躍，Ki-67與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、分期、分級(jí)、復(fù)發(fā)及預(yù)后顯著相關(guān)。Ki-67在多種實(shí)體惡性腫瘤中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織，能反映惡性腫瘤的增殖活性[7]。本研究旨在探索EGFR突變和Ki-67蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與影像組學(xué)定量特征之間的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 采用回顧性方法收集杭州市中醫(yī)院2013年6月—2018年6月經(jīng)病理證實(shí)的肺結(jié)節(jié)患者120例。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)分別為肉芽腫性病變、肺原位癌、微浸潤(rùn)性肺腺癌和浸潤(rùn)性肺腺癌，每組各30例。肉芽腫性病變組為良性肺結(jié)節(jié)，男12例，女18例；年齡42～85歲，平均68.0±13.5歲。肺原位癌組、微浸潤(rùn)性肺腺癌組和浸潤(rùn)性肺腺癌組為惡性肺結(jié)節(jié)，肺原位癌男17例，女13例；年齡45～81歲，平均70.0±15.1歲。微浸潤(rùn)性肺腺癌男18例，女12例；年齡45～81歲，平均74.3±11.0歲。浸潤(rùn)性肺腺癌男16例，女14例；年齡45～88歲，平均72.3 ± 15.3歲。所選患者均有完整的EGFR基因、Ki-67蛋白統(tǒng)計(jì)資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所選患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 肺CT檢查方法 均采用Philips 256i CT(飛利浦公司)進(jìn)行肺部CT掃描，采用肺部掃描模式，范圍從肺尖到肺底，層厚5 mm，層間距5 mm，重建層厚1.5 mm，螺距1.0，矩陣512×512，管電壓120 kV，自動(dòng)毫安秒技術(shù)，迭代算法圖像重建，視野(FOV)330 mm，肺窗窗寬1500，窗位-400。

1.3 肺CT影像組學(xué)定量特征 采用ITK-SNAP軟件進(jìn)行圖像分割。選取層厚為1.5 mm的肺部CT圖像，在包含選定肺結(jié)節(jié)的所有層面沿病灶輪廓逐層放置感興趣區(qū)(region of interest, ROI)，去除鈣化區(qū)域進(jìn)一步調(diào)整ROI。將肺結(jié)節(jié)原始圖像和分割好的肺結(jié)節(jié)立體ROI圖像導(dǎo)入Artificial Intelligent Kit(AK)軟件。通過(guò)AK軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值處理、數(shù)據(jù)劃分、數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后進(jìn)行單因素方差分析+秩和檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)性分析，Lasso回歸及十折交叉驗(yàn)證，提取影像直方圖、形態(tài)學(xué)、灰度共生矩陣(GLCM)、灰度游程長(zhǎng)矩陣(RLM)4個(gè)方面的影像組學(xué)特征。

1.4 EGFR基因位點(diǎn)突變檢測(cè) 采用人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。存在EGFR基因19、21位點(diǎn)突變的病例為EGFR突變組(陽(yáng)性組)，不存在EGFR基因19、21位點(diǎn)突變的病例為EGFR野生型組(陰性組)。

1.5 Ki-67蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用即用型快捷免疫組化MaxVisionTM 2/HRP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞核呈黃色或者棕色者為Ki-67蛋白表達(dá)陽(yáng)性，由兩位高年資病理醫(yī)師根據(jù)切片中細(xì)胞核染色程度分為Ki-67陽(yáng)性組和Ki-67陰性組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 影像組學(xué)特征數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用AK軟件自帶的統(tǒng)計(jì)軟件，其余數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料指標(biāo)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析(r≥0.8，兩變量間高度相關(guān)；0.5 ≤r<0.8，兩變量中度相關(guān)；0.3 ≤r<0.5，兩變量低度相關(guān)；r<0.3，兩變量低度相關(guān)程度弱，基本不相關(guān))，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺影像組學(xué)特征 120例肺結(jié)節(jié)的原始圖像與分割后的圖像一起導(dǎo)入AK軟件，共獲取396個(gè)影像組學(xué)特征，采用單因素方差分析+秩和檢驗(yàn)方法降維后篩查出221個(gè)特征。進(jìn)一步對(duì)221個(gè)特征使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)方法去冗余后剩余75個(gè)特征，最后選用Lasso降維方式及十折交叉驗(yàn)證，特征數(shù)降至5個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 通過(guò)降維篩選的5個(gè)肺影像組學(xué)特征

注：RLM：灰度游程長(zhǎng)矩陣；GLCM：灰度共生矩陣。

2.2 肺結(jié)節(jié)患者EGFR基因突變和Ki-67表達(dá)情況 不同性別，年齡段肺結(jié)節(jié)患者的EGFR基因突變和Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與肉芽腫性病變比較，微浸潤(rùn)性腺癌和浸潤(rùn)性腺癌的EGFR基因突變陽(yáng)性率均增高，原位癌、微浸潤(rùn)性腺癌和浸潤(rùn)性腺癌的Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表2。

表2 肺結(jié)節(jié)患者EGFR基因突變和Ki-67表達(dá)情況

注：*與肉芽腫性病變比較，P<0.05。

2.3 影像組學(xué)特征與EGFR基因突變和Ki-67表達(dá)情況相關(guān)性分析 EGFR基因突變與Inertia_AllDirection_offset4參數(shù)正相關(guān)(r=0.564,P=0.040)，Ki-67蛋白表達(dá)分別與ShortRunlEmphasis_AllDirection_offset1(r=0.359,P=0.042), InverseDifferenceMoment_AllDirection_offset4(r=0.549,P=0.038), Inertia_AllDirection_offset4(r=0.423,P=0.047)正相關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 肺結(jié)節(jié)患者影像組學(xué)特征與EGFR基因突變和Ki-67表達(dá)情況相關(guān)性分析

3 討論

傳統(tǒng)的影像測(cè)量方法不能準(zhǔn)確反映腫瘤的微觀變化，醫(yī)學(xué)影像分析模式需從傳統(tǒng)的醫(yī)師主觀判斷向精準(zhǔn)定量分析模式轉(zhuǎn)化。目前影像組學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為融合影像、基因、臨床等信息的輔助診斷、分析和預(yù)測(cè)的工具[8-9]。CT影像組學(xué)在預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)分子特征方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，有望在肺癌的個(gè)體化治療方面發(fā)揮重要作用。本研究共觀察120例肺結(jié)節(jié)的CT影像，使用AK軟件對(duì)良惡性肺結(jié)節(jié)定量特征降維，篩選得到5組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的影像組學(xué)特征。

張連美等[10]研究顯示，肺癌EGFR基因突變陽(yáng)性率為62.9%。本研究90例肺腺癌中，EGFR基因突變陽(yáng)性率為25.56%(23/90)，陽(yáng)性率低于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與張連美等的研究沒(méi)有限制肺腫瘤的類(lèi)型及大小有關(guān)。有研究表明[11]，腫瘤的類(lèi)型及大小與EGFR基因突變率有一定的相關(guān)性，肺鱗癌組織中EGFR基因突變陽(yáng)性率高于肺腺癌組織中EGFR基因突變陽(yáng)性率，肺腫瘤直徑越大，EGFR基因突變陽(yáng)性率越高。本研究納入的惡性肺結(jié)節(jié)均為肺腺癌且直徑均小于3 cm，可能是導(dǎo)致EGFR基因突變陽(yáng)性率相對(duì)較低的原因。本研究結(jié)果顯示，與肉芽腫性病變比較，微浸潤(rùn)性腺癌和浸潤(rùn)性腺癌的EGFR表達(dá)陽(yáng)性率均明顯增高，提示肺腺癌與EGFR基因突變有一定的關(guān)聯(lián)[4,11-12]。本研究的EGFR基因突變與影像組學(xué)特征的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EGFR基因突變與肺紋理特征Inertia_AllDirection_offset4參數(shù)呈中度相關(guān)性。Inertia反映圖像的清晰度和紋理溝紋深淺的程度，本研究結(jié)果提示EGFR基因突變?cè)谖⒂^形態(tài)上可改變肺CT圖像紋理溝的深度。有研究采用CT影像組學(xué)特征預(yù)測(cè)NSCLC的EGFR突變狀態(tài)[13]，結(jié)果顯示影像組學(xué)預(yù)測(cè)EGFR突變狀態(tài)的ROC曲線下面積達(dá)到0.89。

Ki-67蛋白存在于細(xì)胞核內(nèi)，Ki-67能客觀地反映機(jī)體細(xì)胞的增殖活性[14]。Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，高表達(dá)可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志；Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率與肺腺癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)，Ki-67標(biāo)記指數(shù)已成為鑒別腫瘤良惡程度及侵襲力的重要標(biāo)志之一[15-17]。本研究結(jié)果顯示，90例肺腺癌中，Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率為67.78%(61/90)；與肉芽腫性病變比較，原位癌、微浸潤(rùn)性腺癌和浸潤(rùn)性腺癌的Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率均明顯增高。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，Ki-67蛋白表達(dá)分別與ShortRunlEmphasis_AllDirection_offset1, InverseDifferenceMoment_AllDirection_offset4, Inertia_AllDirection_offset4呈正相關(guān)，提示Ki-67蛋白的表達(dá)可改變肺CT圖像的光滑程度和紋理溝的深淺，改變圖像局部紋理的同質(zhì)性；通過(guò)肺紋理特征，可以較低的成本、客觀地判斷腫瘤的增殖活性，可更早更快速地對(duì)肺腺癌進(jìn)行診治和預(yù)后。

綜上，肺結(jié)節(jié)組織中EGFR基因位點(diǎn)突變和Ki-67蛋白表達(dá)與肺腺癌影像組學(xué)特征有一定的相關(guān)性，結(jié)果還需從擴(kuò)大肺結(jié)節(jié)病理類(lèi)型、擴(kuò)大樣本量、增加機(jī)器型號(hào)、優(yōu)化掃描參數(shù)等方面進(jìn)一步驗(yàn)證。