基于PacBio SMRT技術(shù)的嬰幼兒配方奶粉微生物安全性評價(jià)

邊燕飛 席曉霞 鄭 藝 侯強(qiáng)川 孫天松 孫志宏

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

作為母乳不足時(shí)的替代品，嬰幼兒配方奶粉在牛乳或豆乳的基礎(chǔ)上，調(diào)整和強(qiáng)化蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等主要營養(yǎng)素，從而適合不同階段嬰幼兒生長和營養(yǎng)的需求。我國是世界第二大嬰幼兒配方奶粉消費(fèi)市場，僅2017年1月，我國進(jìn)口嬰幼兒配方奶粉15 091 t，價(jià)值2.16億美元[1]。由于嬰幼兒配方奶粉使用人群的特殊性，所以其質(zhì)量安全監(jiān)控備受關(guān)注。隨著嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)審查的逐漸細(xì)化，徹底杜絕了物化污染的發(fā)生，然而，原料乳營養(yǎng)豐富、生產(chǎn)工藝要求特殊，影響其質(zhì)量安全的一個(gè)重要因素——微生物污染，依然存在。

活性致病微生物是影響嬰幼兒配方奶粉品質(zhì)和安全的重要因素，特別是沙門氏菌和阪崎腸桿菌等，能導(dǎo)致新生兒腦膜炎和壞死性腸炎等疾病的發(fā)生[2-3]。雖然奶粉加工過程中的熱處理工藝可將大量微生物滅活使其符合產(chǎn)品要求，但微生物所產(chǎn)生的耐熱脂肪酶和蛋白酶仍具有活性，能夠降低奶粉溶解度并使之產(chǎn)生異味[4-5]。此外，亦有研究指出許多病原性細(xì)菌在死亡裂解后會(huì)釋放出大量的細(xì)菌內(nèi)毒素并對機(jī)體造成潛在的危害[6-7]。防止嬰幼兒配方奶粉中細(xì)菌的污染對其質(zhì)量與安全至關(guān)重要。

近年來，我國加強(qiáng)了對嬰幼兒配方奶粉污染微生物的監(jiān)管，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010《嬰兒配方食品》[8]基于傳統(tǒng)的細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范了嬰幼兒配方奶粉中污染微生物的具體檢測方法。然而此技術(shù)僅適用于檢測具有活性、豐度較大且可培養(yǎng)的微生物，無法全面反應(yīng)嬰幼兒配方奶粉的微生物污染情況。目前一些分子生物學(xué)檢測技術(shù)因其快速、靈敏的特點(diǎn)，正被廣泛采用，已成為食品安全監(jiān)督的有力工具。其中PacBio SMRT（Single molecule real-time）測序技術(shù)采用宏基因組學(xué)的研究策略，通過將環(huán)境樣品中微生物的基因組混合作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，打破了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于純培養(yǎng)研究的局限性。而且相比于Illumina、454焦磷酸等高通量測序技術(shù)，此技術(shù)無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以直接讀取目標(biāo)序列，在細(xì)菌種水平上揭示樣品的微生物菌群結(jié)構(gòu)及豐度信息[9-11]。此外，ddPCR（Droplet digital PCR）是繼qPCR之后的一種新型定量技術(shù)，此技術(shù)靈敏度高、精確度高以及耐受性高，無需制備標(biāo)準(zhǔn)品即可直接獲得靶分子的濃度或拷貝數(shù)，能夠更加精確地對環(huán)境樣品中的微生物進(jìn)行絕對定量分析[12-13]。

本研究采用PacBio SMRT測序技術(shù)，在分類學(xué)地位“種水平”上精確地揭示嬰幼兒配方奶粉的污染微生物情況，同時(shí)通過ddPCR技術(shù)對其中的致病菌蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌進(jìn)行定量分析。通過本研究，初步建立了嬰幼兒配方奶粉中污染微生物檢測技術(shù)，為大型乳品企業(yè)的污染微生物標(biāo)準(zhǔn)化控制體系提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 某一品牌不同批次的嬰幼兒配方奶粉樣品6份（IF1-IF6）。

1.1.2 試劑 OMEGA DNA isolation kit（貨號：D5625-01）試劑盒，美國 OMEGA 公司；2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司；SMRT Cell、SMRTbellTM Template Prep Kit 1.0試劑盒、DNA Polymerase Binding Kit P6 v2試劑盒、MagBead Buffer Kit v2試劑盒和Qubit定量試劑盒，美國Pacific Biosciences公司；ddPCR Supermix和Droplet Generation Oil，美國 Bio-Rad公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）培養(yǎng)基、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基和乳平板計(jì)數(shù)瓊脂（MPC）培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop公司；veriti梯度基因擴(kuò)增儀，美國AB公司；QX200TM微滴式數(shù)字PCR儀，美國Bio-Rad公司；SMRT RS II測序儀，美國Pacific Biosciences公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基于細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)的嬰幼兒配方奶粉微生物計(jì)數(shù) 根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010《嬰兒配方食品》對嬰幼兒配方奶粉中細(xì)菌菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。參照Y/T 1331-2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》對嬰幼兒配方奶粉中芽孢進(jìn)行計(jì)數(shù)[14]。

1.3.2 嬰幼兒配方奶粉DNA的提取 取1.0 g奶粉樣品，采用OMEGA DNA isolation kit試劑盒提取嬰幼兒配方奶粉宏基因組DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA的純度以及濃度，符合后續(xù)試驗(yàn)要求的DNA置于-20℃冰箱備用。

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列全長擴(kuò)增 將1.3.2節(jié)中提取的DNA作為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因全長序列為目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1.5 μL，模板 DNA 2 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50 μL。16S rRNA基因序列引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACCTTGTTACGACTT-3′）[15]，在正向引物中加入6個(gè)核苷酸標(biāo)簽（Barcode）。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，PCR產(chǎn)物置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PacBio SMRT三代測序 將1.3.3節(jié)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、混樣后，用SMRTbellTM Template Prep Kit 1.0試劑盒對純化后的DNA進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)后的高質(zhì)量DNA構(gòu)建文庫，然后使用DNA/Polymerase Binding Kit P6 v2試劑盒及MagBead Buffer Kit v2試劑盒將構(gòu)建成功的文庫進(jìn)行引物、聚合酶的連接，應(yīng)用PacBio RS II儀器上機(jī)測序。

1.3.5 高質(zhì)量序列的提取 使用RS_ReadsOfinsert.1對1.3.4節(jié)中生成的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制，保留符合以下標(biāo)準(zhǔn)的序列：①最小通過率設(shè)定為5；②最小預(yù)測精確度為90；③最小插入序列長度為1 400 nt；④最大序列長度為1 800 nt。

1.3.6 生物信息學(xué)處理 應(yīng)用QIIME（v1.7.0）平臺，對1.3.5節(jié)生成的高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先采用PyNAST[16]將序列校準(zhǔn)排齊后，在100%和98.65%的相似性下進(jìn)行兩步UCLUST[17]歸并劃分分類操作單元（Operational taxonomic units，OTU）；繼而從各OTU中選取1條代表性序列，使用 RDP（Ribosomal database project）[18]和Greengenes（v13.8）[19]數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行序列同源性比對，進(jìn)而在門、綱、目、科、屬和種水平明確其分類學(xué)地位；最后使用FastTree[20]構(gòu)建基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對超1（chao1）指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（Observed species）、香農(nóng)（Shannon-wiener）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)等 alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。本研究中涉及的序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，序列號為mgp81077。

1.3.7 基于ddPCR技術(shù)的蠟樣芽胞桿菌和大腸桿菌的絕對定量 以1.3.2節(jié)中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×ddPCR Supermix for probes 10 μL，模板 DNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1.2 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，加ddH2O補(bǔ)充至20 μL。將充分混勻的20 μL反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡中，并向微滴發(fā)生卡中加入 70 μL Droplet generation oil，將微滴發(fā)生卡置于微滴發(fā)生器中反應(yīng)。隨后將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96孔板，封膜后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)；98℃ 10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后將96孔板放入QX200 Droplet Reader進(jìn)行檢測，具體引物探針序列如表1所示。

表1 目標(biāo)菌特異性引物及探針Table1 Specific primers and probes of target bacteria

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用Origin8.6軟件（O-riginLab公司）作圖，使用QuantaSoftTMSoftware（Bio-Rad公司）對ddPCR定量結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)的嬰幼兒配方奶粉微生物計(jì)數(shù)

本研究以GB 10765-2010《嬰兒配方食品》為依據(jù)，采用基于細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)對納入本研究的6份嬰幼兒配方奶粉樣品的細(xì)菌菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其菌落總數(shù)分別為40，70，45，50，85，65 CFU/g。值得一提的是，所有樣品均未檢測出大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌和芽孢，因而所有樣品均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 基于PacBio SMRT測序技術(shù)的嬰幼兒配方奶粉污染微生物及豐度分析

2.2.1 測序量及豐度分析 在提取樣品微生物DNA的基礎(chǔ)上，本研究采用宏基因組策略，使用PacBio SMRT測序技術(shù)對嬰幼兒配方奶粉污染微生物進(jìn)行了研究，樣品的測序序列信息和α多樣性指數(shù)如表2所示。

由表2可知，本研究從6份嬰幼兒配方奶粉樣品中共獲得34 435條高質(zhì)量完整的16S rRNA基因序列，每個(gè)樣品平均為5 739條（range=4 034～6 752）。根據(jù)序列的98.65%相似度水平劃分操作分類單元（OTU）后，共得到4 301條具有代表性的細(xì)菌OTU序列。本研究進(jìn)一步使用RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有3.89%的序列不能鑒定到屬水平，8.03%的序列不能鑒定到種水平。由表2亦可知，IF4樣品的α多樣性指數(shù)均低于其它樣品，由此可見IF4樣品的微生物菌群多樣性最低。通過使用稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線，本研究進(jìn)一步對測序深度是否滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求進(jìn)行了評估，其結(jié)果如圖1所示。

表2 樣品的測序序列信息和α多樣性指數(shù)Table2 Sequence abundance and α-diversity in all samples

圖1 稀疏曲線圖（a）和香農(nóng)多樣性圖（b）Fig.1 Rarefaction curves（a）and Shannon diversity index curves（b）

由圖1可知，盡管依據(jù)當(dāng)前的測序量每個(gè)樣品的稀疏曲線未能進(jìn)入平臺期（1a），但香農(nóng)多樣性曲線已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)（1b）。由此可見，在本研究的測序深度下，樣品中細(xì)菌的多樣性已得到充分展現(xiàn)，滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

2.2.2 基于門、屬和種水平嬰幼兒配方奶粉細(xì)菌相對含量的分析 本研究進(jìn)一步使用RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性比對，將所有的序列鑒定為14個(gè)門、138個(gè)屬和255個(gè)種?；陂T水平嬰幼兒配方奶粉中主要細(xì)菌相對含量的分析如圖2所示。

圖2 基于門水平嬰幼兒配方奶粉中主要細(xì)菌相對含量的分析Fig.2 The relative abundance of major bacteria in infant formula at the phylum level

由圖2可知，嬰幼兒配方奶粉中的細(xì)菌主要隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為81.91%和16.52%。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了隸屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）、棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）和放線菌門（Actinobacteria）的細(xì)菌菌群，然而其平均相對含量較低，僅為0.70%，0.37%和0.19%。

基于屬和種水平嬰幼兒配方奶粉中主要細(xì)菌相對含量的分析如圖3所示。

圖3 基于屬（a）和種（b）水平嬰幼兒配方奶粉中主要細(xì)菌相對含量的分析Fig.3 The relative abundance of major bacteria in infant formula at the genus（a）and species（b）level

由圖3a可知，在屬水平上隸屬于硬壁菌門且相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬及其含量分別為：芽孢桿菌屬（Bacillus，58.19%）、乳球菌屬（Lactococcus，12.38%）、鏈球菌屬（Streptococcus，3.89%）和海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus，2.72%）。隸屬于變形菌門且相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬及其含量分別為：假單胞菌屬（Pseudomonas，5.02%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，3.80%）、克呂沃爾氏菌屬（Kluyvera，1.82%）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，1.03%）。

由圖3b可知，在種水平上隸屬于硬壁菌門且相對含量大于1.0%的細(xì)菌種及其含量分別為：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，23.54%）、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus，21.58%）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，6.08%）、沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis，5.39%）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，3.57%）、魚乳球菌（Lactococcus piscium，3.38%）、高地芽孢桿菌（Bacillusaltitudinis，3.12%）、海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus profundus，2.70%）和棉籽糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis，2.49%）。隸屬于變形菌門且相對含量大于1.0%的細(xì)菌種及其含量分別為：莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi，2.98%）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens，1.72%）、瑰麗不動(dòng)桿菌（Acinetobacter guillouiae，2.58%）和維羅納假單胞菌（Pseudomonas veronii，1.15%）。此外在 IF3，IF4，IF5，IF6樣品中檢測到相對含量較低的大腸桿菌，其相對含量分別為0.06%，0.01%，0.15%和0.05%。

2.2.3 基于OTU水平上嬰幼兒配方奶粉中主要污染細(xì)菌組成分析 由于α多樣性分析是基于OTU水平的，因此本研究進(jìn)一步在OTU水平上對嬰幼兒配方奶粉中主要污染細(xì)菌組成進(jìn)行了分析，OTU在6份樣品中出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)如圖4所示。

圖4 嬰幼兒配方奶粉樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)Fig.4 Frequency of occurences of OTU in the infant formula samples

由圖4可知，本研究的6份嬰幼兒配方奶粉樣品共產(chǎn)生4 301個(gè)OTU，其中僅出現(xiàn)1次的OTU有3 243個(gè)，占OTU總數(shù)的75.40%，然而其所包含的序列數(shù)僅為3 572條，僅占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的10.39%。而在6個(gè)樣品中均存在的OTU為148個(gè)，所包含的序列數(shù)為25 752條，分別占OTU總數(shù)和質(zhì)控合格序列數(shù)的3.43%和74.88%。由此可見，雖然某些樣品特有一些種系型，但納入本研究的6份嬰幼兒配方奶粉樣品有大量的核心細(xì)菌菌群。本研究進(jìn)一步對不同樣品中核心OTU的相對含量進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，嬰幼兒配方奶粉樣品中的核心OTU主要由隸屬于芽孢桿菌屬、乳球菌屬、假單胞菌屬和鏈球菌屬的部分菌種構(gòu)成。其中核心OTU中數(shù)量最多的兩個(gè)菌種分別為蠟樣芽孢桿菌和彎曲芽孢桿菌，這一結(jié)果與種水平上細(xì)菌相對含量的分析結(jié)果一致。此外，嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌和魚乳球菌核心OTU的相對含量也較高，就嬰幼兒配方奶粉的主要污染菌種而言，嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌和魚乳球菌均屬于無致病性的乳酸菌。本研究進(jìn)一步對嬰幼兒配方奶粉樣品間核心菌群的相關(guān)性進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖6所示。

圖5 嬰幼兒配方奶粉樣品核心OTU的相對含量Fig.5 The relative abundance of core OTU in infant formula samples

2.3 基于ddPCR技術(shù)對嬰幼兒配方奶粉中蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的定量分析

通過PacBio SMRT測序發(fā)現(xiàn)，6份嬰幼兒配方奶粉樣品中均存在過潛在致病菌蠟樣芽孢桿菌，其中 IF3、IF4、IF5、IF6 樣品中還存在過大腸桿菌。由于通過SMRT測序技術(shù)僅能獲得細(xì)菌的相對含量，因此為進(jìn)一步研究這兩種菌在嬰幼兒配方奶粉中的絕對含量，本研究采用ddPCR技術(shù)對蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌分別做絕對定量分析，結(jié)果如圖7所示。

由圖6可知，魚乳球菌與嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌均呈顯著正相關(guān)（P<0.05），其相關(guān)系數(shù)分別為0.829和0.886。

圖6 嬰幼兒配方奶粉樣品間核心菌群的相關(guān)性Fig.6 The correlation of core bacterial community among infant formula samples

由圖7可知，6份嬰幼兒配方奶粉樣品中均存在過蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌，且蠟樣芽孢桿菌的絕對含量高于大腸桿菌。其中每克奶粉樣品中蠟樣芽孢桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)取對數(shù)后分別為5.32，6.02，5.05，5.76，5.05和5.48，大腸桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)取對數(shù)后分別為5.38，4.90，4.32，4.85，5.18和4.68。

3 討論

本研究首先采用細(xì)菌純培養(yǎng)方法，對6份嬰

圖7 蠟樣芽孢桿菌（a）和大腸桿菌（b）定量結(jié)果Fig.7 Quantitative results of Bacillus cereus（a）and Escherichia coli（b）

幼兒配方奶粉中的大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌和芽孢進(jìn)行檢測，結(jié)果均呈陰性。采用PacBio SMRT測序技術(shù)在種水平上分析嬰幼兒配方奶粉中的污染微生物菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步評價(jià)產(chǎn)品的微生物質(zhì)量。在種水平上，納入本研究的6份嬰幼兒配方奶粉共檢測到255個(gè)細(xì)菌種，其中6份樣品中均存在過嗜冷菌蠟樣芽孢桿菌，其相對含量最高達(dá)到了菌群總量的23.54%。而Zheng等[23]對國內(nèi)外嬰幼兒配方奶粉的研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌為最優(yōu)勢菌種，蠟樣芽孢桿菌的相對含量較低，與本研究結(jié)果不符。Zhila等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在干酪的生產(chǎn)過程中，蠟樣芽孢桿菌主要來源于原料乳，并易殘留在貯藏罐和設(shè)備中。因此究其原因本研究嬰幼兒配方奶粉中含量較高的蠟樣芽孢桿菌極有可能來源于原料乳，或者乳粉加工設(shè)備所造成的二次污染。即使蠟樣芽孢桿菌在乳粉加工過程中已被滅活，但其產(chǎn)生的耐熱胞外蛋白酶，如脂肪酶和蛋白酶的殘留仍可在隨后的乳粉貯藏過程中繼續(xù)分解其中的蛋白質(zhì)和脂肪，進(jìn)而引起產(chǎn)品乳清分離、變色、凝固和發(fā)粘等變質(zhì)現(xiàn)象，從而直接影響產(chǎn)品的口感、營養(yǎng)以及貨架期[5，25]。此外，樣品中還存在蠟樣芽孢桿菌之外的嗜冷菌莓實(shí)假單胞菌，莓實(shí)假單胞菌是原料乳及其乳制品中常見的污染菌，容易在熱處理過程中被殺死，然而其在產(chǎn)品冷藏過程中產(chǎn)生的耐熱肽酶仍具有活性，能夠縮短產(chǎn)品貨架期[26]。通過細(xì)菌菌落總數(shù)的檢測并不能完全反應(yīng)產(chǎn)品的微生物污染程度，因?yàn)椴糠质壤渚奈廴竞茈y通過傳統(tǒng)的細(xì)菌純培養(yǎng)檢出。因此，采用PacBio SMRT測序技術(shù)對嬰幼兒配方奶粉中嗜冷菌的檢測具有極高的可行性。

采用SMRT測序技術(shù)，本研究僅發(fā)現(xiàn)IF3、IF4、IF5、IF6樣品中存在相對含量較低的大腸桿菌。然而，采用ddPCR對大腸桿菌進(jìn)行絕對定量檢測，發(fā)現(xiàn)6份樣品中均存在大腸桿菌的16S rRNA基因。造成兩種檢測結(jié)果不同的原因可能在于IF1和IF2樣品中大腸桿菌的相對含量太低，僅通過SMRT測序技術(shù)無法檢出。雖然上述兩種技術(shù)均檢測出大腸桿菌，但是純培養(yǎng)并未檢出，因此推測大腸桿菌曾經(jīng)存在于原料乳，或是原料乳的加工過程中，并在隨后的加熱過程中被滅活。然而大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，其在死亡裂解時(shí)可釋放出大量富含脂多糖的細(xì)菌內(nèi)毒素。脂多糖具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，不易失活，能引起肝臟組織產(chǎn)生大量炎癥因子和活性氧，從而引發(fā)肝損傷和炎癥反應(yīng)[6]，過量時(shí)還可引起敗血性休克和多器官功能衰竭綜合征[7]，這些污染微生物短期的存在也能夠影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此采用基于非培養(yǎng)技術(shù)的PacBio SMRT測序和ddPCR定量相結(jié)合的技術(shù)手段對嬰幼兒配方奶粉中污染微生物進(jìn)行研究是極為必要的。

此外，值得注意的是，在納入本研究的6份嬰幼兒配方奶粉中，IF4樣品的污染微生物菌群多樣性最低，而其在屬和種水平上優(yōu)勢菌群的相對含量最高。這可能是由于樣品中的少數(shù)微生物過度繁殖導(dǎo)致其相對含量增高，預(yù)示著樣品的污染情況較為嚴(yán)重。此現(xiàn)象在腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究中也有報(bào)道，Mcmurtry等[27]在對新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎的研究中指出，糞便樣品中的微生物多樣性越低，可能預(yù)示著新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎較為嚴(yán)重。因此，本研究的6份嬰幼兒配方奶粉中IF4樣品的微生物污染情況可能更加嚴(yán)重。

4 結(jié)論

本研究的6份嬰幼兒配方奶粉均未檢出致病菌，符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。然而，其存在過的蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌可能增加產(chǎn)品腐敗的風(fēng)險(xiǎn)，影響產(chǎn)品的貨架期。本研究采用細(xì)菌純培養(yǎng)、PacBio SMRT測序和ddPCR相結(jié)合的技術(shù)手段全面評價(jià)了嬰幼兒配方奶粉的微生物污染情況，初步建立了嬰幼兒配方奶粉中污染微生物檢測技術(shù)，為嬰幼兒配方奶粉的污染微生物安全控制提供新的理論指導(dǎo)。