汪昊 牛玉蓉 榮成博

摘要：利用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）和目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，簡稱TRAP）分子標(biāo)記對19個香菇栽培菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，共篩選出34對（條）多態(tài)性豐富的引物，獲得303條數(shù)據(jù)條帶，其中多態(tài)性條帶254條，多態(tài)性比例為83.83%，在遺傳相似系數(shù)為0.75的水平上，將19個菌株分為6類。3種標(biāo)記的多態(tài)性比例排序如下：TRAP（91.14%）>ISSR（83.15%）>SRAP（80.00%）。由結(jié)果可知，綜合不同分子標(biāo)記進(jìn)行香菇的遺傳多樣性分析，可更加準(zhǔn)確地反映菌株間的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：香菇;遺傳多樣性;ISSR;SRAP;TRAP

中圖分類號： S646.1+20.32 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0054-05

我國是世界上最早進(jìn)行香菇人工栽培的國家，據(jù)今已有800多年的歷史[1]。此外，我國也是香菇最大的生產(chǎn)國、消費國和出口國[2]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2016年全國香菇總產(chǎn)量為898萬t，香菇已經(jīng)是我國栽培量最大的食用菌品種。隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的快速發(fā)展，對香菇良種高效選育的要求越來越迫切，對種質(zhì)資源的收集鑒定評價及進(jìn)一步明確資源間的遺傳關(guān)系，是新品種選育的重要前提。由于香菇表型較易受栽培基質(zhì)、栽培模式、管理方法等因素影響，變異性較大，因此，從分子水平對香菇種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行研究，可以更加高效準(zhǔn)確地得出菌株間的親緣關(guān)系。

分子標(biāo)記技術(shù)自20世紀(jì)80年代發(fā)展以來，已被應(yīng)用于多種作物的種質(zhì)資源和育種研究中，特別是在構(gòu)建分子遺傳圖譜、基因定位、分子輔助育種等方面取得了很大進(jìn)展[3]。本研究利用基于PCR的簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）和目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，簡稱TRAP）3種分子標(biāo)記，對我國規(guī)模栽培的香菇品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期快速準(zhǔn)確并多角度地明確香菇栽培菌株的親緣關(guān)系及演化規(guī)律，從而更好地保護(hù)和利用香菇種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究開展的時間為2017年10月至2018年6月，供試的19個香菇菌株均由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所保藏并提供，各供試菌株的名稱、編號及來源見表1。

1.2 培養(yǎng)基

用于香菇菌絲培養(yǎng)的綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方（1 L）：去皮馬鈴薯200 g熬汁，葡萄糖20 g，瓊脂 20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1.5 g，蛋白胨5 g，維生素B1 10 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.3 引物與試劑

試驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;DNA marker、Taq PCR Mix，購自寶生物工程（大連）有限公司;基因組DNA提取試劑盒，購自德國QIAGEN公司。

1.4 香菇基因組的提取

用打孔器將活化的香菇各菌種定量接種在PDA培養(yǎng)基平皿中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右。分別刮取 100 mg 菌絲，用試劑盒提取香菇各菌株的基因組DNA，用紫外-可見分光光度計檢測各DNA在260、280 nm下的吸光度，并將19種DNA的濃度調(diào)為一致。

1.5 PCR反應(yīng)體系和條件

25 μL的ISSR-PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR Mix、1 μL ISSR引物（0.4 μmol/L）、1 μL DNA（30 ng）、10.5 μL 滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。相關(guān)引物序列設(shè)計參考文獻(xiàn)[7]，詳見表2。

25 μL的SRAP-PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR Mix、1 μL SRAP上游引物（0.4 μmol/L）、1 μL SRAP下游引物（0.4 μmol/L）、1 μL DNA（30 ng）、9.5 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。相關(guān)引物序列設(shè)計參考文獻(xiàn)[7]，詳見表2。

25 μL的TRAP-PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR Mix、1 μL TRAP上游引物（0.4 μmol/L）、1 μL TRAP下游引物（0.4 μmol/L）、1 μL DNA（30 ng）、9.5 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，35 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，10個循環(huán);95 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。相關(guān)引物序列為筆者自己設(shè)計，詳見表3。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外成像系統(tǒng)觀察并拍照。各泳道在同一位置上擴(kuò)增出的強帶或可分辨性好的弱帶，視為擴(kuò)增陽性，并賦值“1”，未擴(kuò)增出條帶，視為擴(kuò)增陰性，賦值“0”。用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類分析，采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試香菇菌株的ISSR分析結(jié)果

隨機(jī)選取2個香菇菌株的DNA，用18條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出10條擴(kuò)增條帶較多的引物（表4）。以19個供試香菇菌株的基因組DNA為模板，依次用篩選得到的10個ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出89條DNA片段，其中多態(tài)性條帶數(shù)為74條，多態(tài)性比例為83.15%，擴(kuò)增片段長度多為200～5 000 bp（圖1為以ISSR4為引物的擴(kuò)增結(jié)果），其遺傳多樣性聚類分析結(jié)果見圖2。

2.2 供試香菇菌株的SRAP分析結(jié)果

隨機(jī)選取1個香菇菌株的DNA，用SRAP引物對（表2中2種SRAP引物的隨機(jī)組合）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出15對多樣性較好、條帶清晰的引物組合（表5）。以19個供試香菇菌株的基因組DNA為模板，共擴(kuò)增出135條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為108條，多態(tài)性比例為80.00%，擴(kuò)增片段長度在200～5 000 bp之間（圖3為以Me3/Em6為引物對的擴(kuò)增結(jié)果），其遺傳多樣性聚類分析結(jié)果見圖4。

2.3 供試香菇菌株的TRAP分析結(jié)果

TRAP擴(kuò)增引物包括錨定引物和隨機(jī)引物，隨機(jī)選取1個香菇菌株的DNA，使用TRAP引物對（8個錨定引物，2個隨機(jī)引物）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出9對多樣性較好、條帶清晰的引物組合（表6），以19個供試香菇菌株的基因組DNA為模板，共擴(kuò)增出79條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為72條，多態(tài)性比例為91.14%（表6、圖5為以Em2/Xyl31460A為引物對的擴(kuò)增結(jié)果），其遺傳多樣性聚類分析結(jié)果見圖6。

2.4 19個香菇菌株的聚類分析結(jié)果

由3種分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果可知，供試的19個香菇菌株相似性在0.59～0.99之間，菌株間具有一定的遺傳差異。在遺傳相似系數(shù)為0.75的水平上，ISSR將19個香菇菌株分為5大類，SRAP將19個香菇菌株分為4大類，TRAP將19個香菇菌株分為9大類。在所有供試菌株中，JZB212014和JZB2102081的遺傳相似系數(shù)為0.575，親緣關(guān)系最遠(yuǎn);JZB212050和JZB2102051的遺傳相似系數(shù)為0.97，親緣關(guān)系最近。

3 討論

由于歷史上的引種利用等問題，我國香菇栽培菌株同種異名、同名異種的現(xiàn)象較為嚴(yán)重[4]，研究者們曾經(jīng)利用多種標(biāo)記探究了香菇野生種質(zhì)和栽培種質(zhì)的遺傳多樣性[5-8]。由于采用單一標(biāo)記往往較難獲得理想的結(jié)果，本研究采用3種標(biāo)記逐一篩選并綜合分析構(gòu)建了香菇的遺傳聚類樹（圖7）。用10條ISSR引物、15對SRAP引物和9對TRAP引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析，共得到303個標(biāo)記數(shù)據(jù)，其中多態(tài)性條帶254條，多態(tài)性比例為83.83%。在遺傳相似系數(shù)為0.75的水平上，將19個菌株分為6類。3種標(biāo)記的單獨聚類分析結(jié)果與綜合聚類結(jié)果略有差異，但總體趨勢相同，某些菌株只能由1種分子標(biāo)記區(qū)分， 有的可由2種或者3種標(biāo)記方法同時區(qū)分。例如在0.99的水平上，ISSR、SRAP無法將JZB212050、JZB2102051這2個菌株區(qū)分，而利用TRAP標(biāo)記得到2個菌株的遺傳相似系數(shù)為0.906。由3種標(biāo)記對多態(tài)性的貢獻(xiàn)率可見，TRAP（91.14%）>ISSR（83.15%）>SRAP（80.00%），可能由于3種分子標(biāo)記所檢測的位點不同，所以單個標(biāo)記對菌株分類是有局限性的，須充分利用不同分子標(biāo)記的優(yōu)點來進(jìn)行綜合分析。

TRAP是2003年由Hu等提出的一種新型分子標(biāo)記[9]，可利用已知cDNA序列或表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）序列為固定引物，配合隨機(jī)引進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀標(biāo)記和遺傳多樣性分析等[3]。本研究以美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中的香菇纖維素降解酶系、半纖維素降解酶系和木質(zhì)素降解酶系的相關(guān)基因為靶標(biāo)基因序列，利用TRAP標(biāo)記分析，對19個香菇栽培菌株進(jìn)行了遺傳變異研究。結(jié)果表明，香菇各菌株之間顯示了較高的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解酶基因的遺傳多態(tài)性， 為從特定基因水平上研究香菇遺傳親緣關(guān)系提供了有用的信息。郭春芳等研究發(fā)現(xiàn)，TRAP標(biāo)記比ISSR標(biāo)記更適合茶樹特異種質(zhì)資源和重要農(nóng)藝性狀的篩選[10]。Miklas等研究發(fā)現(xiàn)，TRAP具有標(biāo)記植物抗性基因的潛力[11]，而此方面的研究在食用菌重要農(nóng)藝性狀基因標(biāo)記方面還沒有相關(guān)報道。今后，隨著大規(guī)模測序工作的進(jìn)展，TRAP標(biāo)記技術(shù)將在食用菌品種改良中獲得更多應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chang S T，Miles P G. Historical record of the early cultivation of Lentinus in China[J]. Mushroom J Tropics，1987，7：31-37.

[2]Chang S T. Past and present trends in the production of Lentinla edodes in Asia[J]. Mushroom Biology and Mushroom Products，2002，4：1-8.

[3]郭長奎，于 靜，羅淑萍. 新型分子標(biāo)記TRAP應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究，2009，13（4）：366-369，376.

[4]邊銀丙. 我國香菇栽培種質(zhì)資源與種質(zhì)資源信息庫建設(shè)[J]. 浙江食用菌，2008，16（1）：12-15.

[5]郭金英，宋彥龍，李 超，等. 四十個野生香菇菌株遺傳多樣性分析[J]. 北方園藝，2018（10）：157-160.

[6]孫 勇，林芳燦. 中國香菇自然種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 菌物系統(tǒng)，2003，22（2）：387-393.

[7]劉靖宇，宋秀高，葉 夏，等. 香菇菌株遺傳多樣性ISSR、RAPD和SRAP綜合分析[J]. 食用菌學(xué)報，2011，18（3）：1-8.

[8]卓 英，譚 琦，陳明杰，等. 香菇主要栽培菌株遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 菌物學(xué)報，2006，25（2）：203-210.

[9]Hu J G，Vick B A. Target region amplification polymorphism：a novel marker technique for plant genotyping[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2003，21（3）：289-294.

[10]郭春芳，唐玉海，孫 云，等. 11個茶樹品種遺傳多樣性的ISSR和TRAP比較分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（1）：340-346.

[11]Miklas P N，Hu J G，Grunwald N J，et al. Potential application of TRAP （targeted region amplified polymorphism） markers for mapping and tagging disease resistance traits in common bean[J]. Crop Science，2006，46（2）：910-916.