韓曉偉 曹楸偉 嚴玉平

摘要：利用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）條形碼來鑒定河北某藥材市場北沙參的真?zhèn)纹?，探討分子方法鑒定北沙參藥材真?zhèn)纹返目尚行浴Ｌ崛?2份北沙參樣品的DNA，利用ITS2引物進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行雙向測序，利用CodonCode Aligner軟件進行序列拼接。從Genbank下載13條北沙參序列，利用MEGA 6.0分析比對25份序列，計算其種間、種內(nèi)的Kimura雙參數(shù)遺傳距離（K2P距離）以及各序列的變異位點并進行聚類分析，利用RNA多重排列（locARNA）來預(yù)測北沙參及其偽品的二級結(jié)構(gòu)。12份樣品中10份為北沙參，1份是川明參，1份為祁木香。ITS2序列可以較好地區(qū)分北沙參及其偽品，可作為北沙參鑒定的有效方法而加以推廣。北沙參的DNA條形碼鑒定體系的建立，為DNA條形碼技術(shù)在臨床及市場監(jiān)管領(lǐng)域的實踐應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：北沙參;真?zhèn)纹?ITS2;DNA條形碼;臨床用藥

中圖分類號： R282.710.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0071-05

北沙參（Glehnia littoralis）為傘形科珊瑚菜的干燥根，為我國常用大宗中藥材之一，臨床上主要用于治療肺燥干咳、熱病傷津等癥[1]。北沙參主產(chǎn)于河北安國、山東萊陽、內(nèi)蒙赤峰等地[2]，其中河北安國產(chǎn)北沙參為安國八大祁藥之一，以其條粗順直，無杈無須，被譽為“一柱香”，《神農(nóng)本草經(jīng)》列其為上品。北沙參作為藥食兩用的藥材，受到廣大消費者喜愛，但是由于市場上常有許多北沙參的混偽品作北沙參來用，因此易產(chǎn)生混淆，從而對臨床用藥安全造成威脅。

一直以來利用理化性質(zhì)對北沙參進行鑒定是主要的鑒定方式[3-6]，而DNA條形碼鑒定技術(shù)的發(fā)展為中藥材的鑒定提供了新的工具。陳士林等提出以內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）作為藥用植物鑒定的通用序列并在中藥材鑒定方面進行了大量嘗試[7-8]。目前已有利用ITS2對北沙參進行鑒定的報道[9-10]，這些研究主要關(guān)注藥材原植物的鑒別或原植物與藥材的混合鑒別。本研究是利用ITS2的序列，對河北某中藥材市場的北沙參藥材進行檢測，為DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于藥材市場的監(jiān)管和臨床用藥的安全提供理論和實踐的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

12份北沙參藥材的樣品全部購自河北某藥材市場，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定，憑證樣本保存于河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，其余13個樣本來源于GenBank，樣品來源見表1。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 儀器與試劑 Taq酶[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司];PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司];核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;離心機（Eppendorf中國）;膠回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;其他均為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，測序工作由華大基因完成。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增和測序 提取北沙參干燥根的基因組DNA，利用通用引物ITS2對所提取的DNA進行PCR擴增，引物序列如下：

ITS2F：5′-ATGCGATA-CTTGGTGTGAAT-3′;

ITS2R：5′-GACGCTTCTCC-AGACTACAAT-3′。

擴增反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)體系按照韓曉偉等的方法[11]配制，PCR完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，每份樣品30 μL PCR產(chǎn)物直接送深圳華大基因公司北京測序部進行測序。每份樣品均進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理方法按照韓曉偉等的數(shù)據(jù)處理方式進行[11]。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用RNA多重排列（locARNA）方式進行。

1.2.4 試驗時間和地點 試驗時間為2017年，試驗地點為河北中醫(yī)學(xué)院橘泉校區(qū)科研樓。

2 結(jié)果與分析

2.1 北沙參樣品DNA提取和PCR擴增結(jié)果

提取出12份樣品的DNA后，利用ITS2引物進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，12份樣品均能擴出單一明亮的條帶（圖1），隨后將擴增的產(chǎn)物測序。

2.2 序列的比對與提交

將擴增的12份樣品的ITS2序列經(jīng)CodonCode Aligner軟件校對拼接后，在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12份樣品中有10份為北沙參，1份為川明參，1份是祁木香。重新進行取樣，提取DNA后擴增測序，結(jié)果相同。這說明北沙參藥材中混入了其他品種。將12條序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得了登錄號（表1）。

2.3 北沙參樣品序列的分析

北沙參樣品的ITS2序列長度約為227 bp，在確定的10份北沙參樣品中，MG793244有15個變異位點，MG793246和MG793247序列相同，有6個變異位點，說明北沙參存在較明顯的種間變異（圖2）。而MG793249川明參與北沙參的序列差別較大，表明二者從遺傳組成上是有差別的，不可混用。MG793252祁木香的序列與北沙參基本不同。

2.4 北沙參及其混偽品的種內(nèi)種間遺傳距離分析

基于K2P模型計算北沙參與其混偽品的K2P距離，北沙參種內(nèi)K2P遺傳距離平均為0.002，種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0.004。北沙參與其混偽品的種間遺傳距離最小為0.028，遠遠大于北沙參的種內(nèi)最大遺傳距離，表明ITS2能夠準確區(qū)分北沙參及其混偽品（表2）。

2.5 北沙參及其混偽品的聚類分析

基于得到的12條ITS2序列，然后從GenBank下載13條序列，利用鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹?？梢钥闯觯琈G793241～MG793243、MG793245、MG793248～MG793250共7條序列與GenBank下載的北沙參的序列（KF010586～KF010588）聚為1支。MG793246和MG793247因為與北沙參的種間變異較多而單獨聚為1支，MG793244也因為與北沙參的種間變異較多而單獨聚為1支，這3個樣品的外形與北沙參無異，但因為種間變異數(shù)較多，是否會影響到藥效，須要作更深一步研究。從GenBank下載的KM191311～KM191315均為輪葉沙參，因此聚為1支，KM191316～KM191320均為沙參，因此聚為1支。祁木香MG793252與川明參聚為1支，說明祁木香與川明參有相似之處（圖3）。

2.6 北沙參及其混偽品的二級結(jié)構(gòu)比較

利用locARNA方式對北沙參及其混偽品的ITS2進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，圖4表明，北沙參與川明參和輪葉沙參的二級結(jié)構(gòu)存在較大差異，能夠很明顯的區(qū)分。祁木香的主環(huán)結(jié)構(gòu)與北沙參相似，但其莖環(huán)結(jié)構(gòu)與北沙參相差較大，區(qū)別也較明顯（圖4）。由此可以看出，利用二級結(jié)構(gòu)也能夠很好地區(qū)別北沙參及其混偽品。

3 討論與結(jié)論

我國中藥材資源豐富，種類繁多，但是在藥材流通市場上仍然有摻雜使假現(xiàn)象發(fā)生?！吨袊幍洹罚?015版）中對北沙參的鑒別方法有物理和化學(xué)2種方法，但是這2種方法已經(jīng)不能滿足市場對藥材鑒別方法的需要[12]。DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展為中藥材的鑒定提供了全新的技術(shù)手段，已經(jīng)被《中國藥典》中部分中藥列為藥材鑒定的方法之一。本研究說明了利用DNA條形碼技術(shù)鑒定北沙參藥材的可行性。

在利用DNA條形碼技術(shù)鑒定北沙參藥材的過程中，選擇了不同產(chǎn)地的北沙參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河北安國產(chǎn)的北沙參中有種內(nèi)變異的情況。將發(fā)生種內(nèi)變異的MG793244、MG793246、MG793247 3個樣品重新提取DNA，PCR后送測序，結(jié)果與先前相同，說明確實發(fā)生了種內(nèi)變異，但該變異屬于無害的變異，并未影響到北沙參的性狀。

由于對干燥堅硬的北沙參藥材進行DNA提取，因此在提取過程中進行了多種方法的試驗[13]，通過鋼珠振動將北沙參藥材研磨得盡量細碎，同時通過延長DNA提取時間使干燥細胞充分裂解，從而提高所得DNA的濃度，保證后續(xù)PCR的效果。本試驗中的12份樣品均可擴增出單一明亮條帶，基于K2P距離建立的NJ樹以及二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測都能夠很好地將北沙參及其偽品區(qū)分開來。12份市場藥材中正品10份，偽品1份，祁木香為陰性對照，正品率為83.3%。雖然在12份樣品中只有1份川明參，但是因為川明參和北沙參的功效是不同的， 因此，如果誤將川明參作北沙參入藥，仍會給臨床用

藥帶來隱患。因此，中藥材市場仍須凈化以保證臨床用藥安全。

綜上所述，DNA條形碼技術(shù)能夠準確地鑒別北沙參及其偽品，本試驗所鑒定的12份樣品的結(jié)果與藥材鑒定專家的鑒定結(jié)果一致，說明DNA條形碼技術(shù)是安全、高效的藥材鑒定技術(shù)，在中藥材流通及市場監(jiān)管中有很大的應(yīng)用推廣價值。

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