吳海超 丁 飛 趙 攀

（佳和農(nóng)牧股份有限公司，湖南長沙 410000）

目前很多規(guī)模豬場都建立了本場的動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室。而抗體檢測(cè)方法作為一種評(píng)估豬群健康狀況的手段，以靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定、高通量、易于操作等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床豬場生產(chǎn)中。相比傳統(tǒng)的動(dòng)物疾病診斷方法，抗體檢測(cè)有其巨大的優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)于血清樣本的質(zhì)量要求相對(duì)較高，因?yàn)檠鍢悠返馁|(zhì)量可直接影響抗體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為調(diào)查不合格血清樣品質(zhì)量對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果的影響，同時(shí)也為了確?？贵w檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，特設(shè)計(jì)開展本試驗(yàn)，旨在為規(guī)范豬場送檢合格的血清樣品提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；不同量程移液器，德國Eppendorf公司；離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 檢測(cè)試劑盒

豬瘟病毒抗體試劑盒（批號(hào)：M101）、豬藍(lán)耳病抗體試劑盒（批號(hào)：M211）、豬偽狂病野毒抗體試劑盒（批號(hào)：EP435）購自于美國IDEXX公司，由長沙達(dá)可思生物科技有限公司提供。

1.3 樣品來源

某豬場采集的新鮮血液，樣品包括懷孕母豬、后備母豬、保育豬（46日齡）、育肥豬（142日齡）不同階段豬群血清。

2 方法

2.1 樣品制備

豬場采集不同階段豬群血液各5份，共20份，將采集的每份新鮮血液制備成標(biāo)準(zhǔn)、未分離、輕度溶血和重度溶血4種血清樣品狀態(tài)，具體如下圖（圖1、圖2、圖3、圖4）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)血清

圖2 未分離血清

圖3 輕度溶血

圖4 重度溶血

2.2 樣品分組

根據(jù)制備的4種血清狀態(tài)對(duì)其進(jìn)行分組，將標(biāo)準(zhǔn)血清、未分離血清、輕度溶血和重度溶血血清分別分為A、B、C、D 4組。

2.3 抗體檢測(cè)

分組之后，嚴(yán)格按照豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病野毒抗體試劑盒操作說明書對(duì)4組血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，并保證檢測(cè)時(shí)溫度的穩(wěn)定性和操作條件的統(tǒng)一。

2.4 結(jié)果分析

根據(jù)各項(xiàng)抗體試劑盒檢測(cè)得到的OD值分別計(jì)算4組血清樣品的豬瘟抗體阻斷率、藍(lán)耳病抗體S/P值和偽狂犬病野毒抗體S/N值，以A組標(biāo)準(zhǔn)血清組檢測(cè)結(jié)果為參考值，分析B、C、D 3組血清質(zhì)量不合格組對(duì)各項(xiàng)抗體檢測(cè)結(jié)果的影響。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 各項(xiàng)抗體檢測(cè)結(jié)果

通過同一批號(hào)豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒、藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試劑盒、偽狂犬病野毒抗體檢測(cè)試劑盒在同一室溫條件下對(duì)A、B、C、D 4組血清進(jìn)行了2輪抗體檢測(cè)，通過對(duì)2輪重復(fù)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理，計(jì)算A、B、C、D 4組血清的豬瘟抗體平均阻斷率、藍(lán)耳病抗體S/P平均值和偽狂犬病野毒抗體S/N平均值。發(fā)現(xiàn)4組血清中豬瘟、藍(lán)耳病抗體平均值均以A組標(biāo)準(zhǔn)血清組平均值最低，而偽狂犬病野毒抗體S/N值平均值以A組最高。相比A組，B、C、D 3組質(zhì)量不合格血清組豬瘟抗體和藍(lán)耳病抗體水平普遍上升，而偽狂犬病野毒抗體水平普遍下降，具體結(jié)果見表1及圖5。由此得出，血清質(zhì)量不合格時(shí)，容易使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差，導(dǎo)致豬瘟、藍(lán)耳病及偽狂犬病野毒抗體假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，與岳展尹[1]報(bào)道的結(jié)果一致。尤其是對(duì)于偽狂犬病野毒抗體的檢測(cè)，血清樣品質(zhì)量是否合格影響較大。

圖5 豬瘟、藍(lán)耳病及偽狂犬病野毒抗體平均值變化

3.2 群體檢測(cè)結(jié)果樣本上升與下降

表1 4組血清樣品豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病野毒抗體水平平均值變化

以A組抗體檢測(cè)結(jié)果為參考值，計(jì)算B、C、D 3組豬瘟抗體阻斷率、藍(lán)耳病抗體S/P值和偽狂犬病野毒抗體S/N值。通過對(duì)4組血清樣品抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，相比A組，B、C、D 3組大部分樣品豬瘟抗體、藍(lán)耳病抗體的檢測(cè)結(jié)果存在上升，部分樣品偽狂犬病野毒抗體檢測(cè)結(jié)果存在下降。其中豬瘟抗體和藍(lán)耳病抗體樣品檢測(cè)結(jié)果上升比例達(dá)到了65%以上，偽狂犬病野毒抗體樣本檢測(cè)結(jié)果下降比例在35%以上，具體結(jié)果見表2及圖6。

表2 4組血清樣品豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病野毒抗體檢測(cè)結(jié)果變化比例 （%）

4 討論

通過3種常規(guī)疾病抗體試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清和3組質(zhì)量不合格血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，分析其結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血清樣本質(zhì)量不合格會(huì)對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果造成影響，導(dǎo)致豬瘟抗體阻斷率、藍(lán)耳病抗體S/P值的升高和偽狂犬病野毒抗體S/N值的降低，通過升高或降低樣品的檢測(cè)值從而對(duì)整個(gè)群體的抗體水平造成影響，特別是檢測(cè)結(jié)果在判定值邊界的樣品，如豬瘟抗體阻斷率在90%和30%～40%的樣品，容易導(dǎo)致豬瘟抗體超陽性率和陽性率的升高，藍(lán)耳病抗體S/P值在2.5和0.4左右的樣品，同樣引起藍(lán)耳病抗體超陽性率和陽性率的升高。對(duì)于偽狂犬病野毒抗體的檢測(cè)，判定值在0.6和0.7左右時(shí)，容易導(dǎo)致偽狂犬野毒假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，從而造成對(duì)整個(gè)結(jié)果的誤判。因此保證血清樣品的質(zhì)量在抗體檢測(cè)中顯得尤為重要。

血清樣品的質(zhì)量常受因紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血、室溫或冷藏放置時(shí)間過長和樣品反復(fù)凍融等因素的影響。血清樣品溶血主要由于紅細(xì)胞破裂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物中的水、血紅蛋白（Hb）、無機(jī)鹽等物質(zhì)的釋放，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類似辣根過氧化物酶的作用，當(dāng)血紅蛋白及其他非特異性物質(zhì)吸附至反應(yīng)孔孔壁，與包被的抗原非特異性結(jié)合，在洗滌液未洗干凈時(shí)，催化底物出現(xiàn)顯色反應(yīng)；還有細(xì)胞內(nèi)釋放的一些其他內(nèi)容物與包被物結(jié)合，導(dǎo)致血清中抗體與包被的抗原反應(yīng)減少，從而減弱顯色反應(yīng)[2]。因此樣品發(fā)生不同程度的溶血后均會(huì)影響抗體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)樣品在室溫或者冷藏環(huán)境中放置時(shí)間過長和樣品在-20℃反復(fù)凍融都會(huì)引起血清中抗原抗體的降解，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的影響。因此在進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，保證血清樣品的質(zhì)量很關(guān)鍵。

圖6 4組血清樣品豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病野毒抗體檢測(cè)結(jié)果上升比例

由于本次試驗(yàn)選擇的質(zhì)量不合格血清樣品是由豬場采集的新鮮血液制備而成，因此樣品選擇隨機(jī)性很大，各項(xiàng)抗體檢測(cè)在判定值邊界的樣品較少，且檢測(cè)偽狂犬野毒抗體的血清樣品也全部呈偽狂犬野毒陰性，因此在樣品選擇上存在一定的瑕疵。但是通過本文得出的結(jié)論還是可以明顯看出血清質(zhì)量不合格對(duì)抗體檢測(cè)的影響，希望通過本研究得出的相關(guān)結(jié)果能為豬場規(guī)范送樣流程提供借鑒。