杜鵑花屬(Rhododendron L.)植物 DNA 條形碼鑒定

白霄霞 沈風(fēng)嬌 李志斌 趙建成 蔣淑磊 石碩

摘 ? ?要：杜鵑花屬（Rhododendron L.）植物作為重要觀賞和中藥植物，市場(chǎng)前景廣闊，發(fā)展?jié)摿薮蟆１疚耐ㄟ^歸納杜鵑花屬植物的分類、鑒定相關(guān)問題，發(fā)現(xiàn)利用DNA條形碼可有效解決杜鵑花屬植物（品種）的鑒定問題?；诙霹N花屬植物的具體情況，本文對(duì)序列參考數(shù)據(jù)庫建設(shè)、分子標(biāo)記開發(fā)以及杜鵑花品種的野生親本溯源三方面內(nèi)容進(jìn)行綜述，并結(jié)合GenBank中1 311條杜鵑花屬DNA序列及作者測(cè)序獲得的463條序列，初步建立杜鵑花屬DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，并通過非加權(quán)組平均法利用matK與psbA-trnH序列聯(lián)合建立UPGMA樹，部分杜鵑花屬栽培品種可與野生種聚為一支。綜合說明DNA條形碼技術(shù)可用于對(duì)杜鵑花屬栽培品種開展初步的野生親本溯源。

關(guān)鍵詞：杜鵑花; DNA條形碼;中國(guó)珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺(tái)

中圖分類號(hào)：S685.21; Q941+1 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.001

Abstract： Genus Rhododendron is a group of important ornamental plants and traditional Chinese medicine resources with broad market prospects. In this paper， a DNA barcoding method for effectively solve species （cultivars） identification problems was proposed based on the review of taxonomy and identification history of genus Rhododendron. Three key topics related to DNA barcoding research on genus Rhododendron， which included reference library construction， molecular markers screening and optimization， and cultivars wild relatives tracing， were discussed. The DNA barcodes database of genus Rhododendron was preliminarily constructed with 1 311 DNA sequences in GenBank and 463 sequences generated by the authors. The UPGMA tree was constructed by matK and psbA-trnH sequences， and some cultivated varieties could be grouped with the wild species. The results suggested that DNA barcoding could be used to carry out preliminary wild relatives tracing of cultivated Rhododendron varieties.

Key words： Rhododendron L.; DNA barcoding; BREP

杜鵑花多指杜鵑花屬（Rhododendron L.）植物——《中國(guó)植物志》[1]和《中國(guó)植物志》（英文版）[2]中記錄本屬中文名為“杜鵑屬”，但由于杜鵑花的中文名來自杜鵑鳥[3]即動(dòng)物界中的杜鵑屬（Cuculus L.， Cuculidae），為避免與動(dòng)物學(xué)之“杜鵑”相混淆，此處參考耿玉英[3]的處理，將表示植物的“杜鵑”后面加一“花”字，用中文名“杜鵑花屬”將植物杜鵑與動(dòng)物杜鵑相區(qū)別。

杜鵑花屬最初由林奈在1753年建立[4]，其學(xué)名Rhododendron來源于希臘語，由rhodon（玫瑰）和dendron（樹）組合而來，字面上的意思是“玫瑰樹”[5]。杜鵑花屬包含約1 000個(gè)野生種，雖然不同學(xué)者對(duì)于具體數(shù)字觀點(diǎn)不一[1-3，6-8]，但都承認(rèn)它是種子植物中少見的大屬。權(quán)威的植物學(xué)名數(shù)據(jù)庫The Plant List統(tǒng)計(jì)了杜鵑花屬下物種水平名稱共計(jì)2 506個(gè)（包含雜交種），其中741個(gè)為接受名稱，850個(gè)為異名，另有915個(gè)名稱的地位待定（有待進(jìn)一步分類研究）[7]，可見野生杜鵑花屬植物在物種水平的多樣性非常豐富。杜鵑花的品種數(shù)目則更多，其國(guó)際品種登陸權(quán)威（the International Cultivar Registration Authority for the genus Rhododendron）收錄了上萬個(gè)杜鵑花品種[9]。相對(duì)如此豐富的物種和栽培品種，最初西方對(duì)杜鵑花的分類學(xué)研究和物種描述使用的材料卻僅來自于部分模式標(biāo)本和少量被引種到西方栽培的植株，因此當(dāng)時(shí)對(duì)可利用的分類關(guān)鍵性狀掌握并不完善;且由于杜鵑花在野外極易產(chǎn)生各種變異并伴有雜交，不同學(xué)者對(duì)于杜鵑花的分類存在較多爭(zhēng)議[1-3，6，10]。面對(duì)物種數(shù)量如此之多，而且栽培品種的性狀變異極其復(fù)雜的類群，僅依據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行物種和品種的分類尚存較多問題;而且形態(tài)學(xué)鑒定需要長(zhǎng)期的研究基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)，面對(duì)植物分類鑒定專業(yè)人才缺失的現(xiàn)狀，杜鵑花及其品種的鑒定問題將成為制約相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。如今，在分類研究中注重居群內(nèi)變異的觀察和體現(xiàn)居群概念的標(biāo)本館標(biāo)本研究[11]等方面工作，以進(jìn)一步加深對(duì)杜鵑花屬植物形態(tài)和變異的理解，這將有利于杜鵑花分類問題的更好解決。但更值得注意的是，引入分子生物學(xué)數(shù)據(jù)可以為杜鵑花分類研究提供分子層面數(shù)據(jù)，基于這些數(shù)據(jù)進(jìn)行的分子系統(tǒng)學(xué)研究為杜鵑花分類研究開拓了新的局面[12-19]。在對(duì)杜鵑花屬分類和分子系統(tǒng)學(xué)研究的基礎(chǔ)上，杜鵑花分子鑒定應(yīng)運(yùn)而生[20-28]，特別是利用分子標(biāo)記鑒定物種的DNA條形碼技術(shù)。DNA條形碼技術(shù)也許可以為杜鵑花物種和品種鑒定難題提供一個(gè)可行的、穩(wěn)定的、高效的解決方案。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)，或稱條形碼分子鑒定，是利用基因組中一段“短的”、“標(biāo)準(zhǔn)”的DNA片段來區(qū)分與鑒定生物物種的技術(shù)方法[29]。其名稱來源于類似超市商品上的條形碼——每一種商品的包裝上都有代表這一商品信息的條形碼，而這樣的條形碼在同種商品間是一致的，不同商品間卻絕不相同，通過掃描條碼并與數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)的信息比對(duì)，即可以確定這個(gè)條形碼對(duì)應(yīng)的是哪種商品。所以DNA條形碼鑒定的基本原理是：每個(gè)物種都有不同于其他物種的特有DNA序列;測(cè)定樣本的這段特定DNA序列，并與相應(yīng)的參考序列庫（Library）進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)被測(cè)樣品與參考序列庫序列的相似性便可以將被測(cè)樣本鑒定至不同物種。Ratnasingham等[30]研究表明，上述鑒定過程基本上是可行的。

作為21世紀(jì)新興的技術(shù)之一，DNA條形碼技術(shù)不僅對(duì)傳統(tǒng)物種分類鑒定給予強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且它采用數(shù)字化形式，可以實(shí)現(xiàn)樣本鑒定過程自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)的過度依賴，具有快速、高效、可靠、操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)建立易于應(yīng)用的物種鑒定系統(tǒng)。但是，DNA條形碼技術(shù)尚存一些問題有待解決。第一，在DNA條形碼鑒定時(shí)，需要在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較、搜索，而這個(gè)序列參考數(shù)據(jù)庫必須在鑒定之前建設(shè)完備。只有參考序列庫相對(duì)完善，其中囊括了相關(guān)的所有物種，并對(duì)于每一物種有很好的代表（且物種間的分子序列差異明顯大于物種內(nèi)差異），才有可能進(jìn)行分子鑒定，所以建立完善的DNA形碼參考序列庫是影響DNA條形碼應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵問題。第二，用以鑒定的分子標(biāo)記（Marker），即基因組上特定位置DNA序列，是否具有變異性且易于擴(kuò)增，直接決定著DNA條形碼是否能夠獲取，影響著DNA條形碼鑒定是否可以進(jìn)行，所以分子標(biāo)記的開發(fā)與優(yōu)化是影響DNA條形碼應(yīng)用的另一個(gè)關(guān)鍵問題。第三，具體到眾多栽培杜鵑花的鑒定研究，不可避免地涉及到栽培品種來源問題，特別是不同野生種通過雜交參與栽培品種形成。所以利用DNA條形碼追溯杜鵑花品種的野生親本與鑒定杜鵑花品種是不分割的一個(gè)問題的兩個(gè)方面。綜上所述，結(jié)合杜鵑花屬植物具體情況和作者團(tuán)隊(duì)的工作，本文對(duì)杜鵑花屬植物DNA條形碼研究需要解決的序列參考數(shù)據(jù)庫建設(shè)、分子標(biāo)記開發(fā)以及對(duì)杜鵑花品種的野生親本溯源三方面內(nèi)容進(jìn)行綜述，旨在為杜鵑花資源的利用、育種與開發(fā)提供參考。

1 參考序列庫（Reference library）

1.1 參考序列庫的定義

參考序列庫是對(duì)有代表性的、已被準(zhǔn)確鑒定的不同物種，以及同一物種的不同個(gè)體的DNA條形碼獲取和匯總，序列庫中某一物種的數(shù)據(jù)是代表這一物種的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼合集。這樣的參考序列庫保存了某一類生物具有代表性的條形碼序列集，可以用于鑒定這一類生物的不同物種。

1.2 建設(shè)參考序列庫要解決的關(guān)鍵問題

要保證DNA條形碼鑒定的可操作性，必須有完善的參考序列庫，而參考序列庫的標(biāo)本都應(yīng)當(dāng)來自于被準(zhǔn)確鑒定的物種（品種），只有來自準(zhǔn)確鑒定標(biāo)本的參考序列庫條形碼才是可以用于分子鑒定的“合格”條形碼，所以對(duì)序列庫收錄杜鵑花物種和品種的準(zhǔn)確鑒定是建設(shè)參考序列庫的一個(gè)關(guān)鍵問題。此外，還要考慮用于建設(shè)DNA條形碼庫的樣品代表性，即某杜鵑花品種的參考序列來源植物應(yīng)具代表性，需要采集這一品種一定數(shù)量的不同（分布區(qū)）個(gè)體，這是建設(shè)參考序列庫的另一關(guān)鍵問題。

1.3 已有的研究基礎(chǔ)

對(duì)于杜鵑花的研究來說，如今可以直接使用的參考序列庫數(shù)據(jù)主要來自以下網(wǎng)上平臺(tái)：GenBank是由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）組織建立的DNA（及蛋白質(zhì)）序列數(shù)據(jù)庫，其開放數(shù)據(jù)可供各國(guó)科學(xué)家免費(fèi)下載使用。截止到2017年11月15日，GenBank數(shù)據(jù)庫[31]共有杜鵑花屬植物9 298條核酸序列，已經(jīng)覆蓋了567個(gè)物種。BOLD是專業(yè)的DNA條形碼數(shù)據(jù)網(wǎng)站（Barcoding of Life Data Systems），其中整理和保存了杜鵑花屬植物247個(gè)種的條形碼數(shù)據(jù)，可供DNA條形碼鑒定參考。我國(guó)的相關(guān)研究起步較晚，以科技部基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)“重要生物DNA條形碼的技術(shù)規(guī)范體系與信息系統(tǒng)構(gòu)建”為基礎(chǔ)構(gòu)建的我國(guó)珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺(tái)BREP （Barcode of Rare and Endangered Plant，http：//www.brep.ac.cn），提供了準(zhǔn)確鑒定我國(guó)珍稀瀕危植物及其相關(guān)類群的DNA條形碼參考序列[32]。雖然上述數(shù)據(jù)庫可初步作為杜鵑花植物DNA條形碼的參考序列庫，但其包含物種數(shù)距離杜鵑花屬上千個(gè)物種的數(shù)目尚有一定距離。同時(shí)，GenBank數(shù)據(jù)庫的序列提交幾乎是完全開放的，數(shù)據(jù)的可靠性不能夠完全保證，如果缺乏分類學(xué)者對(duì)所研究標(biāo)本的鑒定和把關(guān)，上傳的序列可能是形態(tài)性狀相似的近緣種的錯(cuò)誤鑒定，如果錯(cuò)誤鑒定的物種收錄進(jìn)參考序列庫，將對(duì)后期的應(yīng)用鑒定造成致命影響;BREP包含的數(shù)據(jù)相對(duì)較少，且多針對(duì)珍稀瀕危植物進(jìn)行研究;BOLD的杜鵑花數(shù)據(jù)庫中多數(shù)種只有一兩條參考序列，這距離同一種要有多數(shù)代表樣品的要求來說還差得遠(yuǎn)[33]。因此，為了達(dá)到較好的分子鑒定效果，還需要加大力度建設(shè)杜鵑花的參考序列庫：一方面，在生產(chǎn)新的DNA條形碼數(shù)據(jù)時(shí)，要盡量吸收專業(yè)分類鑒定學(xué)者參與，確保所使用的標(biāo)本被盡量準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)，對(duì)開放平臺(tái)上的序列數(shù)據(jù)謹(jǐn)慎使用，以寧可不用、不可錯(cuò)用的原則，利用分子數(shù)據(jù)分析手段排除可能的錯(cuò)誤鑒定樣品;另一方面，新建設(shè)的序列庫需要覆蓋到盡量多的野生種和栽培品種，并力求同一種或品種都有不同遺傳背景代表的一定數(shù)目的個(gè)體。

本研究對(duì)GenBank等數(shù)據(jù)庫上相關(guān)序列進(jìn)行了下載、分析、優(yōu)化與整合，初步建立可用于鑒定杜鵑花的分子參考序列庫。同時(shí)，依托現(xiàn)有的“高山杜鵑”及其他杜鵑花品種收集，對(duì)62個(gè)品種（個(gè)體）116號(hào)標(biāo)本進(jìn)行DNA條形碼研究和品種序列基礎(chǔ)庫建設(shè)，對(duì)不同樣品的rbcL、matK、trnH-psbA和ITS共4個(gè)序列完成了擴(kuò)增和測(cè)序，已經(jīng)初步建立本地的杜鵑花品種分子鑒定參考序列庫（表1）。今后我們計(jì)劃與各標(biāo)本館合作，利用標(biāo)本館已經(jīng)相對(duì)準(zhǔn)確鑒定過的植物標(biāo)本的分子材料，進(jìn)行數(shù)據(jù)生產(chǎn)。在收集較豐富的標(biāo)本樣品后，可利用二代測(cè)序技術(shù)批量獲取可用的參考序列，為建設(shè)杜鵑花植物DNA條形碼鑒定參考序列庫提供第一手?jǐn)?shù)據(jù)。

2 分子標(biāo)記

2.1 DNA條形碼研究中的分子標(biāo)記

在DNA條形碼研究中，分子標(biāo)記特指基因組特定區(qū)域的用以區(qū)分物種的DNA序列。DNA條形碼概念提出之初，希望能用一個(gè)短的分子標(biāo)記來區(qū)分來自不同類群的生物，特別是區(qū)別不同物種[29]，但實(shí)踐證明，這樣的條形碼并不容易找到。如今在動(dòng)物中一般使用COI基因，在植物中通常使用rbcL和matK（以及ITS）作為通用的分子標(biāo)記[34-35]，BOLD選擇的分子標(biāo)記就是這樣。但對(duì)于不同具體類群，如杜鵑花科，或杜鵑花屬植物，由于不同類群的特異性，適于其他植物的通用分子標(biāo)記并不一定好用，這體現(xiàn)在分子標(biāo)記引物的擴(kuò)增效果和分子標(biāo)記的分辨率等方面。

2.2 分子標(biāo)記對(duì)于DNA條形碼研究的影響

分子標(biāo)記需要有一定的變異性，從而可以區(qū)別不同的物種;還需要有相對(duì)的穩(wěn)定性，穩(wěn)定性一方面體現(xiàn)在物種內(nèi)部的遺傳距離要小于物種之間的遺傳距離，一方面體現(xiàn)在其片段兩端需要有保守的區(qū)域以便于設(shè)計(jì)引物。此外，引物擴(kuò)增的效率、測(cè)序的成功率，都是決定一個(gè)分子標(biāo)記是否可用于DNA條形碼鑒定的關(guān)鍵因素。當(dāng)然，對(duì)于當(dāng)前的應(yīng)用而言，某一分子標(biāo)記的參考序列庫是否完善也將直接影響到這一條碼在當(dāng)下的可用性。

3 栽培品種野生親本溯源

栽培品種由于來源復(fù)雜，變異性強(qiáng)，老品種親本來源背景可能并不清晰，而新品種可通過雜交、選育的方式快速形成，加之栽培上對(duì)使用的品種來源、栽培歷史往往未能準(zhǔn)確記錄（甚至許多品種的名稱都未能規(guī)范、統(tǒng)一，國(guó)內(nèi)有不少栽培杜鵑花培育的單位，但很少有在品種登陸權(quán)威申請(qǐng)登記品種名稱的），故品種間遺傳背景關(guān)系較難明確。而品種間自然分類關(guān)系不明確將影響對(duì)品種的進(jìn)一步選育、繁殖等開發(fā)、研究。DNA條形碼技術(shù)可以有效地運(yùn)用于當(dāng)下數(shù)以萬計(jì)的杜鵑花品種遺傳背景的分析，或者更準(zhǔn)確地說，對(duì)其野生親本溯源。通過遺傳信息推測(cè)其母父本可能是哪一個(gè)野生物種，或者可能是哪幾個(gè)野生物種之一，這將是分子生物學(xué)運(yùn)用于杜鵑花品種分類研究的利器。本文以分辨率較高的matK與psbA-trnH序列為例，建立UPGMA樹，試圖對(duì)栽培品種野生親本進(jìn)行初步溯源，并將其結(jié)果進(jìn)行展示（圖1）。結(jié)果顯示，利用matK與psbA-trnH二基因序列聯(lián)合建立UPGMA樹時(shí)，部分杜鵑花屬栽培品種可與野生種聚為一支，這說明可以利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)栽培品種展開初步的野生親本溯源工作。

當(dāng)然，具體到DNA條形碼鑒定品種問題，尤其是新品種的分子鑒定，從技術(shù)上看，最為重要的還是參考序列庫的完善，所以這一問題的解決同樣需要進(jìn)一步加強(qiáng)參考序列庫的建設(shè)工作。出于對(duì)上述問題的考慮，或許可以在合適時(shí)候建議新品種的審定（甚至是品種登陸權(quán)威的登記）必須提交DNA條形碼序列作為特征參考指標(biāo)，類似的規(guī)范和實(shí)踐已經(jīng)在菌物分類學(xué)研究[36-37]和中藥DNA條形碼研究[38-39]中得到了應(yīng)用并日益完善。

4 展 望

本文通過對(duì)杜鵑花屬植物DNA條形碼鑒定相關(guān)的原理、技術(shù)和應(yīng)用的簡(jiǎn)要介紹，以及對(duì)存在問題和需要克服困難的分析，建議杜鵑花研究者將野生種的系統(tǒng)分類研究與整合二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行合理結(jié)合，建設(shè)完善的條形碼參考序列庫，并結(jié)合基因組學(xué)研究更深入地篩選分子標(biāo)記，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以更好地將DNA條形碼研究和鑒定技術(shù)運(yùn)用于杜鵑花品種鑒定和相關(guān)研究中。

參考文獻(xiàn)：

[1]FANG M Y， FANG R Z， HE M Y， et al. Flora of China[M]. Vol 14. Beijing： Science press; St. Louis： Missouri botanical garden press，2005.

[2]方瑞征，楊漢碧.中國(guó)植物志（第五十七卷，第一分冊(cè)，杜鵑花科）[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[3]耿玉英.中國(guó)杜鵑花屬植物[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2014.

[4]LINNAEUS C. Species plantarum[M]. Sweden： Stockholm，1753.

[5]HARPER， DOUGLA S. Rhododendron [DB/OL].[ 2017-01-23].http：//www.etymonline.com/index.php？allowed_in_frame=0&search=rhododendron.

[6]CHAMBERLAIN D， HYAM R， ARGENT G， et al. The genus Rhododendron： its classification and synonymy[M]. Edinburgh： Royal botanic garden edinburgh， 1996.

[7]ANON. THE PLANT LIST[DB/OL].[2017-11-21].http：//www.theplantlist.org.

[8]ANON. Rhododendron[DB/OL].[2017-11-21].https：//en.wikipedia.org/wiki/Rhododendron.

[9]THE ROYAL HORTICULTURAL SOCIETY. RHS the international cultivar registration authority for the genus Rhododendron[DB/OL].[2017-11-21].https：//www.rhs.org.uk/plants/plantsmanship/plant-registration/Rhododendron-cultivar-registration/Rhododendron.

[10]SLEUMER H. Einsystem der gattung Rhododendron L.[J]. Botanische jahrbuch systematic， 1949， 74：511-553.

[11]洪德元.關(guān)于提高物種劃分合理性的意見[J].生物多樣性，2016，24（3）：360-361.

[12]KRON K. Phylogenetic relationships of Rhododendroideae （Ericaceae）[J]. American journal of botany， 1997， 84（7）：973-980.

[13]SCHEIBER S M， JARRET R L， ROBACKER C D， et al. Genetic relationships within Rhododendron L. section Pentanthera G. Don based on sequences of the internal transcribed spacer （ITS） region[J]. Scientia horticulturae， 2000， 85（1）：123-135.

[14]KURASHIGE Y， ETOH J I， HANDA T， et al. Sectional relationships in the genus Rhododendron （Ericaceae）： evidence from matK and trnK intron sequences[J]. Plant systematics and evolution， 2001， 228（1）：1-14.

[15]高連明，楊俊波，張長(zhǎng)芹，等.ITS序列分析探討杜鵑屬映山紅亞屬的組間關(guān)系[J].云南植物研究，2002，24（3）：313-320.

[16]GAO L M， LI D Z， ZHANG C Q， et al. Infrageneric and sectional relationships in the genus Rhododendron（Ericaceae） inferred from ITS sequence data[J]. Acta botanica sinica， 2002， 44（11）：1351-1356.

[17]MILNE R. Phylogeny and biogeography of Rhododendron subsection Pontica， a group with a tertiary relict distribution[J]. Molecular phylogenetics and evolution， 2004， 33（2）：389-401.

[18]GOETSCH L， ECKERT A J， HALL B D. The molecular systematics of Rhododendron （Ericaceae）： a phylogeny based upon RPB2 gene sequences[J]. Systematic botany， 2005， 30（3）：616-626.

[19]YAN LJ， LIU J， MOLLER M， et al. DNA barcoding of Rhododendron （Ericaceae）， the largest Chinese plant genus in biodiversity hotspots of the Himalaya-Hengduan Mountains[J]. Molecular ecology resources， 2015， 15（4）：932-944.

[20]KOBAYASHI N， TAKEUCHI R， HANDA T， et al. Cultivar identification of evergreen azalea with RAPD method[J]. Journal of the Japanese society for horticultural science， 1995， 64：611-616.

[21]劉義梅.杜鵑花屬藥用植物DNA條形碼的鑒定研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[22]周泓.杜鵑花品種資源多樣性研究及品種分類體系構(gòu)建[D].杭州：浙江大學(xué)，2012.

[23]GAO L M， LIU J， CAI J， et al. A synopsis of technical notes on the standards for plant DNA barcoding[J]. Plant diversity and resources， 2012， 34（6）：592-606.

[24]LIU Y F， XING M， ZHAO W， et al. Genetic diversity analysis of Rhododendron aureum Georgi （Ericaceae） located on Changbai Mountain using ISSR and RAPD markers[J]. Plant systematics and evolution， 2012， 298（5）：921-930.

[25]陳建梅，王釗宇，張立娜，等.基于ITS條形碼技術(shù)分析北京云蒙山杜鵑花屬遺傳多樣性[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（25）：43-48.

[26]肖政，蘇家樂，劉曉青，等.32個(gè)杜鵑花品種遺傳關(guān)系的SRAP分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，31（4）：123-128.

[27]沈德周，縱丹，周安佩，等.AFLP引物組合數(shù)對(duì)準(zhǔn)確分析馬纓杜鵑遺傳多樣性的影響[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（6）：22-28.

[28]廖菊陽，吳林世，劉艷，等.28種杜鵑親緣關(guān)系ISSR分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2018，36（2）：133-138.

[29]HEBERT P D N， CYWINSKA A， BALL S L， et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the royal society b： biological sciences， 2003， 270（1512）：313-321.

[30]RATNASINGHAM S， HEBERT P D N. Bold： the barcode of life data system （www.barcodinglife.org）[J]. Molecular ecology notes， 2007， 7（3）：355-364.

[31]GEER L Y， MARCHLER-BAUER A， GEER R C， et al. The NCBI biosystems database[J]. Nucleic axids research， ?2010， 38：492-496.

[32]李長(zhǎng)昊，程濤，董文攀，等. “中國(guó)珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺(tái)”簡(jiǎn)介[J].生物多樣性，2014，22（1）：110.

[33]CUENOUD P， SAVOLAINEN V， CHATROU L W， et al. Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL， atpB， and matK DNA sequences[J]. American journal of botany， 2002， 89： 132-144.

[34]YU J， XUE J H， ZHOU S L. New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms[J]. Journal of systematics evolution， 2011， 49（3）： 176-181.

[35]DONG W P， CHENG T， LI C H， et al. Discriminating plants using the DNA barcode rbcL b： an appraisal based on a large data set[J]. Molecular ecology resources， 2014， 14（2）： 336-343.

[36]VINCENT R， DUONG V， AMOR A B H， et al. MycoBank gearing up for new horizons[J]. Ima fungus， 2013， 4（2）：371-379.

[37]HAWKSWORTH D L， CROUS P W， Redhead S A， et al. （308-310） Proposals to permit DNA sequence data to serve as types of names of fungi[J]. Taxon， 2016， 65（4）：899-900.

[38]CHEN S L， YAO H， HAN J P， et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS one， DOI： 10.1371/journal.Pone.0008613，2010.

[39]陳士林.中藥DNA條形碼：分子鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012.