連朋 王麗娟

摘 ? ?要：植物種質(zhì)資源是最重要的自然資源之一，也是植物育種的基礎(chǔ)。因此，研究植物種質(zhì)資源保存技術(shù)對(duì)維持物種多樣性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)是指植物材料在液氮（-196 ℃）超低溫環(huán)境中可以長(zhǎng)期保存，以保持其遺傳穩(wěn)定性。本文對(duì)植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)的起源、研究現(xiàn)狀、保存原理、具體方法、影響因素以及保存時(shí)間進(jìn)行了歸納總結(jié)，并概述了其在草莓種質(zhì)資源保存、脫毒苗培育及草莓再生苗遺傳穩(wěn)定性方面的應(yīng)用，提出其在發(fā)展的過程中凍存機(jī)理、材料凍存前后生理狀態(tài)和普適性技術(shù)體系方面的研究有待于進(jìn)一步深入的觀點(diǎn)，并指出其在材料脫毒、抗性育種和遺傳轉(zhuǎn)化方面的廣闊發(fā)展前景，旨在為該技術(shù)在植物種質(zhì)資源保存方面的深入研究和進(jìn)一步拓展應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：種質(zhì)資源;超低溫保存;草莓;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S668.4; S325 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.002

Abstract： ?Plant germplasm resources are one of the most important natural resources and the basis of plant breeding. Therefore， it is of great practical significance to study the conservation technology of plant germplasm resources to maintain species diversity. The cryopreservation technology of germplasm resources refers to the long-term preservation of plant materials in liquid nitrogen （-196 ℃） cryopreservation environment to maintain their genetic stability. In this paper， the origin， research status， preservation principle， specific methods， influencing factors and preservation time of cryopreservation technology for plant germplasm resources were summarized， and its application in preservation of strawberry germplasm resources， cultivation of virus-free seedlings and genetic stability of regenerated strawberry seedlings were summarized. It was pointed out that the research on freezing mechanism， physiological state and universal technical system of materials before and after freezing need to be further deepened， and that it had broad prospects for development in material detoxification， resistance breeding and genetic transformation. The paper is to provide reference for further research and application of this technology in plant germplasm conservation.

Key words： ?germplasm resources; cryopreservation; strawberry; research progress

植物種質(zhì)資源是指包含各種遺傳物質(zhì)的植物總稱，又被稱作遺傳資源或品種資源，包括栽培種、野生種和人工培育的各種植物的品種或品系[1]。隨著科學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，工業(yè)、農(nóng)業(yè)、制造業(yè)需求不斷增長(zhǎng)，人類掠奪式開采自然資源的方式嚴(yán)重威脅著植物種質(zhì)資源的保存，目前全球有近十萬種植物（超過世界植物種類的1/3）瀕臨消失的邊緣，我國(guó)約有15%的植物瀕臨消失，并且全球氣候變暖使這種狀況更為惡化[2]。據(jù)估計(jì)，過去的3個(gè)世紀(jì)，物種絕跡速度被人為地提高了1 000多倍，大部分城市地區(qū)和栽培作物原產(chǎn)地的野生資源及其近緣種都瀕臨絕跡[3]。

植物種質(zhì)資源保存方法分為3種：傳統(tǒng)保存法、離體保存法和超低溫保存法。傳統(tǒng)保存法分為原生境保存和異生境保存兩種[4]，可以較好地保存一些稀有或者即將滅絕的物種以及一些人們需求的特有物種，有助于人們對(duì)這些植物種質(zhì)資源的開發(fā)和使用，但需要大量的土地和人力資源，消耗的成本較高，并且容易遭受各種病蟲害和自然災(zāi)害的侵襲。離體保存法是利用植物細(xì)胞的全能性以及組織培養(yǎng)技術(shù)獲得細(xì)胞、組織、器官特定培養(yǎng)材料，通過改變培養(yǎng)材料生長(zhǎng)的外部環(huán)境條件，使其生長(zhǎng)速度降至最低限度，以達(dá)到保存種質(zhì)的目的[5]，離體保存的材料不僅需要按期繼代，而且可能會(huì)發(fā)生染菌和褐化現(xiàn)象導(dǎo)致材料失活[6]，另外隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加保存的材料可能會(huì)發(fā)生遺傳變異[7]。超低溫保存法一般是在液氮（-196 ℃）的超低溫條件下保存植物細(xì)胞、組織或器官，經(jīng)過超低溫保存的植物材料能保持正常的細(xì)胞活性、全能性和遺傳穩(wěn)定性，從而達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間保存種質(zhì)資源的目的[8]。

本文主要從保存原理、研究現(xiàn)狀、具體方法、影響因素、保存時(shí)間幾個(gè)方面對(duì)植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)進(jìn)行歸納總結(jié)，并對(duì)其在草莓種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用進(jìn)行概括，旨在為該技術(shù)在植物種質(zhì)資源保存方面的深入研究和進(jìn)一步拓展應(yīng)用提供參考。

1 種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)

1.1 原理及現(xiàn)狀概述

植物種質(zhì)資源超低溫保存指的是將植物的器官、細(xì)胞等材料置于液氮（-196 ℃）中使其始終處于超低溫的環(huán)境下進(jìn)行保存的技術(shù)[9]。處于超低溫保存的植物材料暫停一切新陳代謝活動(dòng)，經(jīng)過解凍和恢復(fù)培養(yǎng)該材料再次具有正常細(xì)胞的生理活性和遺傳穩(wěn)定性。在這一變化過程中，凍存的細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分沒有發(fā)生本質(zhì)性改變，僅在物理結(jié)構(gòu)方面發(fā)生變化，不會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)以及相關(guān)代謝功能，因此在植物材料解凍后仍然能夠保持普通細(xì)胞的正常生理活性及遺傳穩(wěn)定性，防止因長(zhǎng)期繼代培育而造成的基因突變和染色體變異等，從而可以實(shí)現(xiàn)安全、有效的長(zhǎng)期凍存植物材料[10]。

超低溫保存是目前唯一可以長(zhǎng)期保存植物種質(zhì)資源且不需要繼代培育的成本較低的技術(shù)，甚至被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源長(zhǎng)久、穩(wěn)定保存的唯一途徑[11]。該技術(shù)的發(fā)展起源于對(duì)冷凍保護(hù)劑作用的了解，其保存過程中植物細(xì)胞需經(jīng)歷劇烈的降溫和升溫變化，故超低溫保存成功的關(guān)鍵是避免降溫過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶生成以及溫度改變對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)和代謝酶活性的影響[12]。1949年P(guān)olge發(fā)現(xiàn)甘油可以減輕超低溫對(duì)鳥類精子的凍存破壞，1959年二甲基亞砜（DMSO）開始被作為冰凍保護(hù)劑[13]。Nag等[14]于1973年首次報(bào)道了利用超低溫保存技術(shù)成功凍存蘿卜懸浮細(xì)胞的研究。自此以后，經(jīng)過近四十年的探索和發(fā)展，從開始相對(duì)落后的快速降溫冷凍法、逐漸降溫冷凍法[15]，至1981年Fahy首次提出植物細(xì)胞玻璃化（即在比較慢的冷卻速率下利用高濃度的冷凍保護(hù)劑溶液使植物細(xì)胞進(jìn)入玻璃化狀態(tài)）的概念[16]，提升發(fā)展為玻璃化法[17]、包埋玻璃化法[18]、小液滴玻璃化法[15]等，使超低溫保存技術(shù)日趨完善。截止到2018年，我國(guó)已建成1座國(guó)家種質(zhì)資源長(zhǎng)期庫、1座復(fù)份庫、10座中期庫及種質(zhì)資源信息系統(tǒng)，保存48.1萬余份的種質(zhì)資源，保存數(shù)量位居世界第二，為作物科學(xué)和遺傳育種提供了雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。

1.2 方 法

目前，植物莖尖、芽和分生組織的超低溫保存方法主要有如下5種[20]。

1.2.1 慢凍法 也稱為二步冷凍法，以緩慢的速度連續(xù)降溫到-196 ℃，或者將材料以0.5～2.5 ℃·min-1的降溫速度持續(xù)降溫到-30～-40 ℃，然后再將莖尖直接浸沒液氮中;或者在-30～-40 ℃預(yù)凍一段時(shí)間，然后再將莖尖浸沒于液氮中。

1.2.2 快凍法 ? ?即在預(yù)處理溫度下，將材料徑直浸沒于液氮凍存。

1.2.3 包埋脫水法 ? ?首先是將材料用海藻酸鈣包埋，然后將包埋后的保存材料放在含有高濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，之后用通風(fēng)設(shè)備或硅膠對(duì)包埋小珠進(jìn)行干燥脫水處理后投入液氮凍存。

1.2.4 玻璃化法 ? ?在材料經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后，用高濃度的玻璃化液在常溫或0 ℃條件下進(jìn)行加載處理和脫水處理，然后再將莖尖浸沒于液氮中凍存。

1.2.5 包埋玻璃化法 ? ?先是用海藻酸鹽包埋材料，然后用玻璃化液進(jìn)行誘導(dǎo)脫水，最后將其直接浸沒于液氮凍存。

1.3 影響因素

超低溫保存材料能否成功是由材料特性、預(yù)培養(yǎng)方法、冷凍保護(hù)劑、冷凍方法等因素共同決定的[9]。

1.3.1 材料特性 ? ?因植物種類不同其基因型不同，同一植物的不同部位或者相同植物相同部位的不同大小其生理活性也不同，導(dǎo)致冷凍成效差別較大，因此植物材料的選擇非常重要[21]。例如超低溫保存蘋果莖尖時(shí)，6周齡時(shí)成活率只有27% ，而29周齡時(shí)成活活率達(dá)到86%[22-23];張玉芹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，體積較小的百合組培球莖尖凍存成活率比較高但之后的恢復(fù)培育比較難，而體積較大的百合組培球莖尖成活率較低但之后的恢復(fù)培育較為容易。

1.3.2 預(yù)培養(yǎng)方法 ? ?主要目的是減小細(xì)胞內(nèi)自由水含量，有低溫鍛煉和干燥處理兩種方法[9]。低溫鍛煉可提高細(xì)胞液的滲透勢(shì)和植株內(nèi)的α-亞氨基酸和聚胺的濃度，增強(qiáng)材料細(xì)胞的抗寒性，故預(yù)培養(yǎng)可在相當(dāng)程度上增加植物材料的成活率[25]。陳加利等[26]通過對(duì)不同低溫鍛煉時(shí)間對(duì)扁桃莖尖存活率的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，以4周這個(gè)時(shí)間點(diǎn)為界限，隨著低溫（4 ℃）鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng)，扁桃莖尖經(jīng)過超低溫保存后的成活率呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢(shì)，而扁桃莖尖沒有經(jīng)過低溫鍛煉就進(jìn)行超低溫保存，其成活率為0。干燥處理是使植物細(xì)胞的含水量居于一個(gè)合適保存水平，防止植物材料細(xì)胞內(nèi)的水分在冷凍過程中生成冰晶對(duì)植物造成破壞[27]。

1.3.3 冷凍保護(hù)劑 ? ?可以在一定程度上減少超低溫對(duì)植物材料造成的傷害，冷凍保護(hù)劑可以分為滲透保護(hù)劑和非滲透保護(hù)劑[28]。滲透保護(hù)劑有甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亞砜等化學(xué)試劑，分屬小分子物質(zhì)，容易穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞液中的水分子融合，可阻止凍存材料在冷凍和化凍時(shí)因過度脫水而死亡[29]。其中二甲基亞砜自身就為毒性物質(zhì)，用保護(hù)劑處理材料時(shí)會(huì)對(duì)其在一定程度上造成傷害，所以在超低溫保存時(shí)應(yīng)合理選擇冷凍保護(hù)劑的種類和用量，及其處理的時(shí)間和溫度，否則冷凍保護(hù)劑就起不到應(yīng)有的保護(hù)作用[30]。非滲透保護(hù)劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇等，分屬大分子物質(zhì)，不能穿過細(xì)胞，但在超低溫保存之前，能優(yōu)先融合溶液中的水分子[29]。

1.3.4 冷凍方法 ? ?不同的冷凍方法具有不一樣的降溫速度，而降溫速度的快慢又會(huì)影響超低溫保存后植物材料的成活率，所以不同植物材料的最優(yōu)降溫速度又不一樣，器官水平上的植物材料則由植物實(shí)現(xiàn)低溫鍛煉的強(qiáng)度決定冷凍方法，細(xì)胞水平上的植物材料主要由細(xì)胞膜的通透性能決定冷凍方法[25]。

1.3.5 解凍方法 ? ?超低溫保存有冷凍和解凍這兩個(gè)急速變溫的過程，不僅要選擇適宜的降溫冷凍方法，還要選擇合適的升溫解凍方法，阻止植物材料在升溫過程中細(xì)胞內(nèi)溶液發(fā)生二次結(jié)冰現(xiàn)象，以及細(xì)胞在升溫回暖過程中吸水的滲透作用對(duì)細(xì)胞膜造成破壞[31]。目前，應(yīng)用較多的解凍方法有常溫自然解凍、常溫水浸泡解凍和水浴加熱解凍3種，應(yīng)根據(jù)不同的凍存材料，選擇不同的合適的解凍方法[32]。

1.4 保存時(shí)限

理論上超低溫保存技術(shù)可以“無限期”地保存植物種質(zhì)資源。1903年瑞典物理化學(xué)家Arrhenius研究了溫度對(duì)化學(xué)反應(yīng)速度的影響，發(fā)現(xiàn)低溫能有效降低生物生化反應(yīng)速度，并得出了Arrhenius關(guān)系式：K=A×exp（-Ea/RT），式中，K為反應(yīng)速率，R為氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，Ea為活化能，A為Arrhenius因子（常數(shù)），計(jì)算出生物材料在液氮（-196 ℃）下可保存上百年[33]。

Ozkavukcu等[34]報(bào)道了經(jīng)超低溫保存50年的牛精子解凍后的生理活性及其功能沒有發(fā)生太大變化;Caswell等[35]報(bào)道了經(jīng)過超低溫保存28年的豌豆和草莓莖尖恢復(fù)再生成功;Walters等[36]報(bào)道了蘋果休眠芽經(jīng)超低溫保存20年嫁接后仍能成活。但是目前對(duì)于超低溫保存技術(shù)研究時(shí)間尚短，所以其所能保存的極限時(shí)間需要更長(zhǎng)的研究時(shí)間來驗(yàn)證。

2 超低溫保存技術(shù)在草莓植物中的應(yīng)用

2.1 草莓種質(zhì)資源現(xiàn)狀

2.1.1 野生品種資源 ? ?野生草莓在抗逆性、抗病性、獨(dú)有香氣和賞識(shí)性等很多方面擁有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，可以用作抗性育種的親本[37]。1962—2009年，德國(guó)學(xué)者Staudt[38]考查了亞洲、歐洲和美洲的野生草莓品種資源，并對(duì)從世界各地采集的草莓屬植物樣本進(jìn)行了比較研究，歸納解決了草莓屬植物品種分類中存在的同種異名問題，完善了草莓品種的劃分體系，認(rèn)為全球大概有24種草莓屬植物，絕大多數(shù)草莓種均為野生或半野生狀態(tài)[39]。Hummer等[40]在德國(guó)學(xué)者Staudt的分類基礎(chǔ)上增加了一個(gè)五倍體草莓種，即布氏草莓（Fragaria×bringhurstii Staudt），并且首次發(fā)現(xiàn)了天然的十倍體草莓種。

我國(guó)是世界野生草莓的發(fā)源地之一，亦是野生草莓資源種類最富饒的國(guó)家之一，擁有約14個(gè)野生草莓品種，主要分布在西南、西北和東北地區(qū)，這些地區(qū)都是野生草莓種質(zhì)資源純天然的基因庫，生長(zhǎng)著種類繁多的野生草莓品種，保存著很多的種、變種和類型，是寶貴的草莓種質(zhì)資源[39，41]。1981年起，我國(guó)著手建造國(guó)家果樹草莓種質(zhì)資源圃，對(duì)我國(guó)分散的野生草莓資源進(jìn)行了考察收集與保存，其中以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)相關(guān)工作最為突出，是世界上收集保存野生草莓品種最多的單位之一，至2010年累計(jì)收集保存國(guó)內(nèi)外野生草莓種質(zhì)資源285份，為我國(guó)野生草莓種質(zhì)資源保存和分類使用研究奠定了根基[42-43]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全國(guó)共收集保存的野生草莓、本地栽植品種、國(guó)外引進(jìn)栽植品種、培育的新品種等草莓種質(zhì)資源大概有1 000余種[44]。

2.1.2 栽培品種資源 ? ?世界上最早栽植草莓的國(guó)家是法國(guó)，其早在14世紀(jì)時(shí)就有栽植草莓的歷史記錄，當(dāng)時(shí)栽植的是原生于歐洲的野生種草莓，果輕且品質(zhì)不好[39]。1750年，歐洲培育出弗州草莓與智利草莓的天然雜交種草莓即鳳梨草莓（Fragaria×ananassa Duch. ex Lamarck），由于其果形氣味均與鳳梨相似而聞名，鳳梨草莓是近代現(xiàn)有草莓栽培品種的祖先[45]。全世界現(xiàn)有的草莓栽培種類多達(dá)2 000多種，并且仍在不斷培育出新品種[39]。

我國(guó)利用野生草莓資源進(jìn)行種間雜交育種事業(yè)起步較遲，栽植品種資源主要有國(guó)內(nèi)自行培育的品種以及從國(guó)外引進(jìn)的歐美品種和日本品種[46-47]。我國(guó)的草莓育種大體可分為3個(gè)階段：第1階段為20世紀(jì)50年代，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)領(lǐng)頭實(shí)施的實(shí)生選種階段，培養(yǎng)出的品種有‘紫金、‘五月香等;第2階段為80年代末期到90年代末期，由原本的2家育種機(jī)關(guān)發(fā)展到8家育種機(jī)關(guān)，而且育種方法也逐漸從實(shí)生選種改變?yōu)殡s交育種;第3階段為21世紀(jì)至今，草莓育種進(jìn)入到了極速進(jìn)展階段，目前已經(jīng)育成了約有 119 個(gè)草莓品種[48]。

2.2 超低溫保存技術(shù)在草莓種質(zhì)資源保存上的應(yīng)用

Caswell等[35]從草莓試管苗培養(yǎng)物分離出分生組織，用低溫保護(hù)劑處理，緩慢冷凍至-40 ℃后并于1979年儲(chǔ)存在液氮中，2007年解凍91個(gè)樣本進(jìn)行體外培養(yǎng)，其成活率（59%）與原始研究報(bào)告中1979年冷凍保存8周后的成活率（56%）差別不大，這是目前所有關(guān)于草莓超低溫保存研究中唯一保存時(shí)間最長(zhǎng)且成活率高于50%的報(bào)道。

Yamamoto等[49]對(duì)15個(gè)草莓品種進(jìn)行了鋁冷凍板玻璃化法超低溫保存研究，結(jié)果表明，將草莓匍匐莖在5 ℃先進(jìn)行3周冷馴化，切取1.5～2.0 mm莖尖于2 mol·L-1甘油和0.3 mol·L-1蔗糖培養(yǎng)基上在5 ℃培養(yǎng)2 d，然后用海藻酸鈉凝膠包埋，25 ℃在加載液中浸泡30 min，之后再PVS2中浸泡50 min，保存于液氮中，解凍后將附在冷凍板上的莖尖直接浸入2 mL1 mol·L-1蔗糖溶液中進(jìn)行再生，得出15個(gè)草莓品種莖尖超低溫保存后平均再生率達(dá)到了81%。

Hofer[50]對(duì)107個(gè)栽培種草莓和20個(gè)野生種草莓品種（50份）的基因型譜進(jìn)行了綜合測(cè)定并對(duì)其玻璃化法超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，將草莓匍匐莖進(jìn)行14 d低溫馴化（-1 ℃，16 h黑暗;22 ℃，8 h光照），然后切取莖尖（1～2 mm）進(jìn)行DMSO預(yù)培養(yǎng)、冰上PVS2玻璃化、液氮保存、恢復(fù)培養(yǎng)，得出栽培種草莓和野生草莓平均再生率分別為89.55%和85.50%，該技術(shù)被應(yīng)用為德國(guó)國(guó)家草莓基因庫183個(gè)草莓品種和德累斯頓-皮爾尼茨新野生草莓基因庫收集的270個(gè)草莓品種的超低溫保存標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)。

2.3 超低溫保存技術(shù)在草莓脫毒苗培育上的應(yīng)用

羅婭等[51]利用超低溫保存技術(shù)對(duì)‘紅顏草莓進(jìn)行脫毒苗的培育，結(jié)果表明，在含0.3 mol·L-1預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d，室溫下LS（加載液）裝載60 min，0 ℃下PVS2脫水1 h，液氮處理1 h，40 ℃水浴化凍120 s，用含1.2 mol·L-1蔗糖的液體MS培養(yǎng)基洗滌2次，獲得脫毒苗的再生率為69.03%，利用RT-PCR病毒檢測(cè)體體系檢測(cè)出脫毒苗中不含草莓4種主要病毒（草莓皺縮病毒、草莓斑駁病毒、草莓鑲脈病毒和草莓輕型黃邊病毒），即獲得的‘紅顏草莓脫毒苗脫毒率達(dá)到了100%。

陳曦等[52]以‘福莓1號(hào)草莓莖尖為材料，對(duì)玻璃化法超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，外植體低溫鍛煉2 周、莖尖暗培養(yǎng)3 d，1/2濃度PVS2溶液及全濃度PVS2溶液0 ℃進(jìn)行2次處理，液氮冷凍保存1 h以上，40 ℃的水浴中快速解凍2 min，卸載后莖尖先暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)，再生培養(yǎng)成活率約30%，4種主要病毒的脫除率為100%。

2.4 超低溫保存后草莓再生苗遺傳穩(wěn)定性分析

朱文濤[53]以野生種‘五葉草莓和攜帶草莓輕型黃斑病毒的‘全明星草莓為材料，研究了超低溫保存的最佳條件、超低溫脫除草莓輕型黃斑病毒的效率、超低溫保存后草莓基因組DNA序列的穩(wěn)定性以及基因組DNA甲基化的變化水平。結(jié)果表明，草莓組織培養(yǎng)材料在4 ℃條件下低溫?zé)捗?周，切取2～3 mm的離體莖尖，4 ℃下在固體預(yù)處理培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，25 ℃下液體預(yù)培養(yǎng)液浸泡30 min，20 ℃下PVS2處理1 h時(shí)，‘五葉草莓和‘全明星草莓成活率分別達(dá)到79.7%和64.3%，采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)分析了超低溫前后的‘五葉草莓和‘全明星草莓的基因組DNA序列，沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性差異條帶，即經(jīng)過超低溫之后的草莓植株基因組DNA序列穩(wěn)定，但是‘五葉草莓和‘全明星草莓基因組DNA甲基化水平分別降低了6.73%和3.83%。

3 超低溫保存中存在的問題及前景展望

超低溫保存技術(shù)是目前種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的理想方法，已成功應(yīng)用于上百種植物，隨著超低溫保存技術(shù)的發(fā)展，可保存材料范圍不斷擴(kuò)大，材料保存時(shí)間也不斷延長(zhǎng)。但是，目前對(duì)超低溫保存的研究多側(cè)重于驗(yàn)證某種植物的超低溫可貯性，以及保存技術(shù)的研究，對(duì)凍存機(jī)理以及材料凍存前后生理狀態(tài)的研究尚不深入。此外，該技術(shù)尚未形成普遍適用于各種材料的超低溫保存技術(shù)體系，也就是說一種材料一種方法，換種材料就需要重新探索一種新的處理方法。雖然物種進(jìn)行規(guī)?；蜏乇４娴臄?shù)量仍較少，但是植物種質(zhì)資源的超低溫保存技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景，尤其在材料脫毒、抗性育種和遺傳轉(zhuǎn)化方面將具有更大的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]奉斌，魏忠芬，伍林濤，等.向日葵種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀及類型[J].北京農(nóng)業(yè)，2015（17）：12.

[2]MICHAEL H. Biodiversity： Frozen futures[J]. Nature， 2008， 452（7186）：404-405.

[3]吳永杰，李玉生，吳雅琴，等.植物種質(zhì)資源保存研究進(jìn)展[J].河北果樹，2019（1）：1-3.

[4]吳婭妮，王文科，孟淑春.植物種質(zhì)資源保存現(xiàn)狀與對(duì)策研究（英文）[J].Agricultural science & technology，2013，14（5）：732-737.

[5]CAPUANA M，LONARDO ?S D . In vitro conservation of chestnut （Castanea sativa） by slow growth[J]. In vitro cellular & developmental biology-plant， 2013， 49（5）：605-610.

[6]史芳芳.生長(zhǎng)抑制劑對(duì)草莓莖尖離體保存的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1574-1575，1657.

[7]呂化榮. 柑橘多倍體愈傷組織長(zhǎng)期繼代保存過程中遺傳變異的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[8]OZUDOGRU E A， PREVIATI A， LAMBARDI M. In vitro conservation and cryopreservation of ornamental plants[M]// Protocols for in vitro propagation of ornamental plants. New York： Humana press， 2010.

[9]宋友遠(yuǎn)，黃建建，占志勇.植物種質(zhì)資源的超低溫保存[J].南方林業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：37-40.

[10]莊春慧.玉蟬花種質(zhì)資源超低溫保存和種子胚再生體系的建立[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2015.

[11]劉月學(xué)，王家福，林順權(quán).超低溫保存技術(shù)在果樹種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用[J].福建果樹，2001（3）：25-27.

[12]WITHERS L A. Low temperature storage of plant tissue cultures[J]. Advances in biochemical engineering， 1980，18：101-150.

[13]張曉寧.香石竹種質(zhì)資源小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[14]NAG K K， STREET H E. Carrot embryogenesis from frozen cultured cells[J]. Nature， 1973，245（5423）： 270 -272.

[15]FAHY G M， TAKAHASHI T， MERYMAN H T. Biological aspects of ice-free cryopreservation[M]//SIBINGA C T S， DAS P C， GREENWALT T J. Future developments in blood banking. Germany： Springer ，1986.

[16]林田，楊華，韓靜，等.玻璃化法及小液滴玻璃化法對(duì)香石竹莖尖超低溫保存效果的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（19）：105-107，141.

[17]張玲，田洪濤，劉錦濤，等.胡楊休眠莖尖的包埋玻璃化法冷凍保存研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，54（12）：2232-2238.

[18]李萬義.桃葉衛(wèi)矛超低溫保存及其效果分析[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2017.

[19]劉旭，李立會(huì)，黎裕，等.作物種質(zhì)資源研究回顧與發(fā)展趨勢(shì)[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2018，8（1）：1-6.

[20]張永卓.部分中國(guó)原產(chǎn)甜柿種質(zhì)甜澀性狀的鑒定及其超低溫保存的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[21]陳志林，李開綿.植物種質(zhì)資源的超低溫保存[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：231-237.

[22]ZHAO Y， WU Y， ENGELMANN F， et al. Cryopreservation of apple in vitro shoot tips the droplet freezing method[J]. Cryo letters， 1999， 20： 109-112.

[23]WU Y， ENGELMAN F， ZHAO Y， et al. Cryopreservation of apple shoot tips： Importance of cryopreservation technique and of conditioning of donor plants[J]. Cryo letters， 1999， 20： 121-130.

[24]張玉芹，李錫香，馬慶，等.食用百合種質(zhì)的玻璃化法超低溫保存技術(shù)初探[J].中國(guó)蔬菜，2004（4）：13-15.

[25]文彬.植物種質(zhì)資源超低溫保存概述[J].植物分類與資源學(xué)報(bào)，2011，33（3）：311-329.

[26]陳加利，姜喜，肖巍，等.扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存條件研究[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（2）：110-114.

[27]YAMAMOTO S I， FUKUI K， RAFIQUE T， et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of strawberry by the vitrification method using aluminiumcryo-plates[J]. Plant genetic resources， 2012， 10（1）：14-19.

[28]付旭鋒，劉平，陳冰冰，等.間充質(zhì)干細(xì)胞凍存方法的研究進(jìn)展[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，38（4）：652-660.

[29]商麗煌.人參、西洋參、三七超低溫保存研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[30]陳曉玲，張金梅，辛霞，等.植物種質(zhì)資源超低溫保存現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2013，14（3）：414-427.

[31]簡(jiǎn)令成，孫德蘭，孫龍華.甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究[J].Journal of integrative plant biology，1987（2）：123-131，232.

[32]林田，楊華，韓靜，等.玻璃化法及小液滴玻璃化法對(duì)香石竹莖尖超低溫保存效果的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（19）：105-107，141.

[33]華澤釗，任禾盛.低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1994.

[34]OZKAVUKCU S， EREDEMLI E. Cryopreservation： Basic knowledge and biophysical effects[J].J ankara med school， 2002， 24： 187-196.

[35]CASWELL K L ，KARTHA K K . Recovery of plants from pea and strawberry meristems cryopreserved for 28 years[J]. Cryo letters， 2009， 30（1）：41-46.

[36]WALTERS C，VOLK G M，TOWILL L E，et al. Survival of cryogenicallystored dormant apple buds： A 20 year assessment[C]//The lst international symposium on cryopreservation in horticultural species. Leuven： The conference scientific committee，2009： 25.

[37]趙密珍，王靜，袁華招，等.草莓育種新動(dòng)態(tài)及發(fā)展趨勢(shì)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2019，20（2）：249-257.

[38]STAUDT G. Strawberry biogeography， genetics and systematics[J]. Acta horticulturae， 2009（842）：71-84.

[39]侯麗媛，董艷輝，聶園軍，等.世界草莓屬種質(zhì)資源種類與分布綜述[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（1）：145-149.

[40]HUMMER K E， BASSIL N， NJUGUNA W. Fragaria[M]// KOLE C. Wild crop relatives genomic and breeding resources. https：//doi.org/10.1007/978-3-642-16057-8.Germany：Springer， 2011： 17-44.

[41]朱薇，楊明摯.中國(guó)野生草莓資源研究及利用進(jìn)展[J].中國(guó)南方果樹，2012，41（4）：50-52，58.

[42]雷家軍，薛莉，代漢萍，等.世界草莓屬（Fragaria）植物的種類與分布[C]//草莓研究進(jìn)展（IV）.北京：中國(guó)園藝學(xué)會(huì)，2015. [43]劉玲.四倍體野生草莓的誘導(dǎo)與四倍體黃毛草莓的低溫脅迫效應(yīng)[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[44]鄧明琴，雷家軍.中國(guó)果樹志 草莓卷[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2005：104-116.

[45]QIN Q， LI X， QIA W， et al. Comparative transcriptomics of strawberries（Fragaria spp.） provides insights into evolutionary patterns[J]. Frontiers in plant science， 2016， 7（1）：1-10.

[46]侯麗媛，張春芬，聶園軍，等.草莓品種及其選育方法研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（12）：2038-2043.

[47]陳潔，劉田田，徐雪平，等.草莓品種資源和遺傳育種研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)業(yè)，2014（9）：31-33.

[48]常琳琳，董靜，鐘傳飛，等.中國(guó)育成草莓品種的系譜分析[J].果樹學(xué)報(bào)，2018，35（2）：158-167.

[49]YAMAMOTO S， FUKUI K， RAFIQUE T， et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of strawberry by the vitrification method using aluminiumcryo-plates[J].Plant genetic resources，2012，10（1）：14-19.

[50]HOFER M.Cryopreservation of in vitro shoot tips of strawberry by the vitrification method-establishment of a duplicate collection of Fragaria germplasm[J]. Cryo letters， 2016， 37（3）：163.

[51]羅婭，邱靜，凌亞杰，等.超低溫療法在草莓病毒脫除中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2016，14（9）：2488-2494.

[52]陳曦，黃銘奇，陳銑，等.‘福莓1號(hào)草莓莖尖超低溫脫毒技術(shù)[J].東南園藝，2018， 6（6）：31-34.

[53]朱文濤.五葉草莓和帶病毒鳳梨草莓的超低溫保存及其遺傳穩(wěn)定性分析[D].開封：河南大學(xué)，2013.