茶多酚對(duì)壬基酚所致白鯽魚胚胎發(fā)育毒性的改善作用

陳建華，謝艷穎

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

【研究意義】 壬基酚聚氧乙烯醚（NPEOs）是目前全球商用第二大類的非離子表面活性劑，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)（造紙、紡織、橡膠、塑料等）、農(nóng)業(yè)（農(nóng)藥乳化劑等）以及日常生活（清洗劑、服裝、化妝品等）中。在NPEOs生產(chǎn)和使用過程中，其降解產(chǎn)物壬基酚(nonylpheol，NP) 最終經(jīng)工業(yè)廢水、生活污水和城市污水等多種渠道進(jìn)入水環(huán)境中[1]。進(jìn)入水環(huán)境中的NP降解困難，現(xiàn)有對(duì)NP的處理方法不能實(shí)現(xiàn)水體NP的完全轉(zhuǎn)化，水體中的痕量NP可以通過水生生物的高度富集而擴(kuò)大濃度，從而對(duì)水產(chǎn)魚類多臟器及胚胎發(fā)育產(chǎn)生毒性，降低魚類的生育能力，導(dǎo)致魚類品質(zhì)下降、減產(chǎn)及魚苗繁殖困難；此外，因富集而擴(kuò)大濃度的NP還可以通過食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而影響人類健康。研究資料表明，在長江、珠江等多條江河水系、水產(chǎn)品的養(yǎng)殖用水、池塘，甚至人們的飲用水中都檢測(cè)到NP的存在，在常食深海魚油的婦女乳汁和性早熟患兒血清中也都檢測(cè)到NP[2-7]。NP通過染毒水產(chǎn)魚類、降低其品質(zhì)進(jìn)而危害人類健康的風(fēng)險(xiǎn)客觀存在。在目前無法完全去除水環(huán)境NP的條件下，對(duì)NP所致水產(chǎn)魚類胚胎毒性作用的改善研究將有利于水產(chǎn)魚類品質(zhì)、產(chǎn)量的提高及優(yōu)質(zhì)魚苗的培育?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 研究表明，生物體內(nèi)，有毒物質(zhì)的代謝將產(chǎn)生大量活性氧，當(dāng)機(jī)體內(nèi)活性氧不能被及時(shí)清除時(shí)，可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致抗氧化酶活性的改變和膜脂質(zhì)過氧化的損傷，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷[8]。一定量的NP能導(dǎo)致海洋微藻、蛤蜊抗氧化系統(tǒng)的破壞，表明壬基酚誘發(fā)機(jī)體活性氧的形成導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)的損傷是壬基酚誘發(fā)水生生物毒性反應(yīng)的機(jī)制之一[9-11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 茶多酚是茶葉中提取出來的天然物質(zhì)，占茶葉干重的15%～25%，不僅具有抗畸變、防癌抗癌的能力，對(duì)機(jī)體活性氧自由基和脂類自由基也具有顯著的清除能力，此外茶多酚還是一種優(yōu)良的解毒劑，能拮抗外源污染物等化學(xué)物質(zhì)對(duì)肝、腎的損傷并保護(hù)機(jī)體免受化學(xué)物質(zhì)的致畸作用[12-15]。劉振興等[16]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加一定量的茶多酚可以顯著提高羅非魚的生長性能和免疫力，表明魚飼養(yǎng)中添加茶多酚具有可行性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 利用白鯽魚胚胎為研究材料，研究NP對(duì)白鯽魚胚胎的毒性影響，同時(shí)探討茶多酚對(duì)NP所致白鯽魚胚胎毒性的改善作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生白鯽魚親魚于繁殖季節(jié)（2017、2018年3—4月）在閩江捕獲，分別進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)，試驗(yàn)地點(diǎn)為福建師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。催產(chǎn)激素LRHA2和 DOM購自寧波第二激素制品廠。NP（化學(xué)純）購自南京奧多福尼生物科技有限公司，用無水乙醇（分析純）助溶，配制成250 mg/mL。茶多酚（純度＞95%）購自天津希恩思生化科技有限公司。挑選性成熟雌雄魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，混合注射，自然產(chǎn)卵受精，取受精后24 h的健康胚胎進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)期間水溫18～20 ℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NP對(duì)白鯽魚胚胎的毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)清水對(duì)照、溶劑乙醇對(duì)照和NP染毒處理。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，NP染毒處理設(shè)3個(gè)質(zhì)量濃度梯度（ 0.04、0.40、4.00 mg/L），每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)放置200個(gè)胚胎。每隔24 h半量更換試驗(yàn)用水，試驗(yàn)用水均以預(yù)先曝氣48 h的自來水配置，試驗(yàn)容器為24.5 cm×24.5 cm×9 cm的塑料盆，內(nèi)置2 L試驗(yàn)用水進(jìn)行充氣孵化。每天觀察并記錄胚胎發(fā)育情況，卵凝結(jié)或心臟停止搏動(dòng)為胚胎死亡標(biāo)志。于受精后7 d按以下公式統(tǒng)計(jì)胚胎孵化率及幼魚畸形率:

1.2.2 茶多酚對(duì)NP所致白鯽魚胚胎毒性的改善試驗(yàn) 根據(jù)NP毒性試驗(yàn)結(jié)果，選取一定濃度的NP液為NP對(duì)照，在此基礎(chǔ)上添加不同濃度的茶多酚進(jìn)行毒性改善試驗(yàn)。按照10倍稀釋的方法將茶多酚配置成 0.35、3.50、35.00 μg/L 3個(gè)濃度處理。每個(gè)處理2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)放置200個(gè)胚胎。具體方法參照1.2.1。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 11.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用線性回歸分析NP的染毒劑量與效應(yīng)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)NP所致白鯽魚胚胎孵化毒性的改善

2.1.1 NP對(duì)白鯽魚胚胎孵化的毒性作用 結(jié)果（圖1）表明，與清水對(duì)照相比，溶劑乙醇對(duì)胚胎的發(fā)育不僅沒有抑制作用，還顯著提高了胚胎的孵化率，這可能與乙醇抑制水霉菌的生長、改善胚胎孵化環(huán)境有關(guān)。與溶劑乙醇對(duì)照相比，中、低濃度（0.04～0.40 mg/L）NP能顯著降低白鯽魚胚胎的孵化率，高濃度（4.00 mg/L）NP對(duì)白鯽魚的胚胎毒性強(qiáng)，孵化作用影響明顯，胚胎接觸高濃度NP 24 h后即發(fā)生心跳停止、血循環(huán)終止，表現(xiàn)為停育現(xiàn)象，其7 d孵化率為0。

圖1 NP對(duì)胚胎孵化的影響Fig.1 Toxic effects of NP on embryo hatching

2.1.2 茶多酚對(duì)胚胎孵化的改善作用 選取0.40 mg/L的NP為基礎(chǔ)液，在此基礎(chǔ)上添加不同濃度的茶多酚進(jìn)行胚胎孵化的改善試驗(yàn)，結(jié)果（圖2）表明，低濃度（0.35 μg/L）的茶多酚處理胚胎的孵化率與NP對(duì)照沒有顯著差異，中濃度（3.50 μg/L）的茶多酚處理胚胎的孵化率比NP對(duì)照顯著提高，而高濃度（35.00 μg/L）茶多酚處理胚胎的孵化率明顯低于中濃度（3.50 μg/L）茶多酚處理，與NP對(duì)照沒有明顯差異，表明僅適當(dāng)濃度（3.50 μg/L）的茶多酚能提高胚胎的孵化。

圖2 茶多酚對(duì)胚胎孵化的改善Fig.2 Improvement of embryo hatching by tea polyphenols

2.2 茶多酚對(duì)NP所致白鯽魚胚胎發(fā)育畸形的改善

2.2.1 NP對(duì)白鯽魚胚胎發(fā)育的影響 胚胎染毒24 h的發(fā)育觀察結(jié)果顯示，清水對(duì)照、溶劑乙醇對(duì)照和低、中濃度（0.04～0.40 mg/L）NP染毒處理的胚胎中絕大多數(shù)發(fā)育正常，可觀察到胚胎卵膜內(nèi)具有明顯的視泡與尾部，尾部卷縮細(xì)長達(dá)頭部，身體背面皮膚、腹腔壁、卵黃囊表面覆蓋大量分散的黑色素，頭部下方搏動(dòng)的心臟清晰可見，且有紅色的血液流至心臟（圖3A）。但高濃度（4.00 mg/L）NP對(duì)胚胎的致畸作用強(qiáng)烈，染毒24 h后即表現(xiàn)為胚胎尾部明顯的發(fā)育不良，發(fā)育停滯于心跳期，光學(xué)顯微鏡下可以觀察到高濃度（4.00 mg/L）NP中胚胎具有明顯的視泡，心臟內(nèi)可見紅色血液，但不見血液流動(dòng)及心臟跳動(dòng)，尾部發(fā)育不完全（圖3B）。

胚胎染毒48 h后，仔魚開始陸續(xù)孵化出膜，剛孵出的仔魚喜歡側(cè)臥靜止，多數(shù)仔魚形態(tài)正常，顯微鏡下可以觀察到其尾部筆直，背鰭、臀鰭、尾鰭鰭褶相連呈薄膜狀；黑色素斑點(diǎn)已遍布頭部、背部、軀干部；心臟正常跳動(dòng)，血液周身循環(huán)（圖4A）。少數(shù)仔魚存在發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)在：卵黃囊水腫，卵黃囊明顯大于正常仔魚的卵黃囊，表現(xiàn)出明顯的卵黃囊吸收延遲現(xiàn)象（圖4B）；脊柱往一側(cè)彎曲，或者呈 “S”形彎曲（圖4C）；尾部向背部一側(cè)翹起彎曲（圖4D）；斷尾上翹同時(shí)伴有卵黃囊吸收延遲的現(xiàn)象（圖4E）；尾部發(fā)育不良，長度明顯短于正常仔魚尾部（圖4F）。

圖3 染毒24 h的胚胎Fig.3 Embryos exposed for 24 h

圖4 NP染毒后孵化仔魚的畸變形態(tài)Fig.4 Abnormal shapes of larval exposed to NP

對(duì)受精7 d的仔魚畸形率統(tǒng)計(jì)顯示，溶劑乙醇對(duì)照仔魚畸形率與清水對(duì)照沒有顯著性差異，說明溶劑乙醇對(duì)白鯽魚沒有明顯的致畸作用，而中、低濃度（0.04～0.40 mg/L）的NP對(duì)孵化仔魚具有顯著的致畸作用（圖5），且孵化仔魚的畸形率與NP濃度呈正相關(guān)。以NP染毒濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)孵化仔魚的畸形率進(jìn)行回歸分析，其方程式為：Y=7.59X -3.88 （R=0.94，P＜0.01），相關(guān)關(guān)系經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有極顯著意義。

2.2.2 茶多酚對(duì)NP所致胚胎發(fā)育畸形的改善 在0.40 mg/L的NP基礎(chǔ)液中加入不同濃度茶多酚后發(fā)現(xiàn)，與NP對(duì)照相比，在本試驗(yàn)的濃度范圍（0.35～35.00 μg/L）內(nèi)茶多酚均能明顯降低仔魚的畸形率（圖6）。

綜上所述，NP對(duì)白鯽魚胚胎的發(fā)育具有一定的毒性作用，不僅顯著降低胚胎的孵化率，而且顯著性提高孵化仔魚的畸形率，高濃度的NP能迅速導(dǎo)致胚胎停育；在NP中加入適量茶多酚不僅能顯著提高白鯽魚的孵化率，還能顯著降低NP所致白鯽魚仔魚的畸形率。

圖5 NP對(duì)孵化仔魚的致畸毒性Fig.5 Abnormal rate of larval induced by NP

圖6 茶多酚對(duì)胚胎發(fā)育畸形的改善Fig.6 Improvement of the abnormal rate by tea polyphenols

3 討論

NP在水體中廣泛存在，其對(duì)水生生物的胚胎發(fā)育毒性具有普遍性，目前已知 NP對(duì)斑馬魚、玫瑰無須鲃、金魚等魚類的胚胎發(fā)育具有毒性。然而不同魚種的胚胎對(duì)NP的敏感性并不一致。張慧等[17]對(duì)斑馬魚胚胎毒性的試驗(yàn)顯示，僅高濃度的NP 才能顯著降低斑馬魚的孵化率并導(dǎo)致尾部畸形率和心包囊腫率增多，而中、低濃度NP對(duì)斑馬魚受精卵的發(fā)育沒有顯著性影響。金魚胚胎毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然低濃度NP對(duì)金魚的囊胚和原腸胚發(fā)育沒有明顯影響，但能造成胚胎尾部脊索的彎曲，而高濃度NP對(duì)胚胎毒性強(qiáng)，引發(fā)胚胎出現(xiàn)畸形增多、卵凝結(jié)及死亡等異常情況[19]。玫瑰無須鲃胚胎對(duì)NP敏感性高，即使低濃度的NP也能對(duì)玫瑰無須鲃的受精卵產(chǎn)生毒性，引發(fā)受精卵發(fā)育延遲和脊椎畸形；高濃度的NP對(duì)玫瑰無須鲃毒性強(qiáng)烈，受精卵僅處理2h即發(fā)生胚盤損失和卵黃渾濁，繼而出現(xiàn)卵凝結(jié)而死亡[18]。本試驗(yàn)利用NP對(duì)白鯽魚胚胎進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)白鯽魚胚胎對(duì)NP同樣敏感，中低濃度的NP不僅降低了胚胎的孵化率，而且還顯著提高了孵化仔魚的畸形率，高濃度NP對(duì)白鯽魚胚胎毒性極強(qiáng)，直接導(dǎo)致胚胎的停育，NP對(duì)白鯽魚胚胎發(fā)育的這種毒性影響，與玫瑰無須鲃的胚胎毒性試驗(yàn)結(jié)果非常類似。

不同發(fā)育時(shí)期的胚胎對(duì)NP敏感性的不同是影響胚胎發(fā)育結(jié)果的原因之一。一般認(rèn)為魚類受精卵在早期卵裂過程中，由于胚胎細(xì)胞處于高度分裂期，此時(shí)的胚胎對(duì)外界環(huán)境高度敏感，外環(huán)境的有毒物質(zhì)往往通過影響細(xì)胞分裂而導(dǎo)致卵裂終止和胚胎死亡。卵凝結(jié)和發(fā)育停滯是NP對(duì)卵裂期胚胎發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)形式。囊胚期和原腸胚的胚胎對(duì)NP的敏感性比受精卵卵裂期的胚胎弱一些，雖然NP造成囊胚期和原腸胚的胚胎發(fā)育時(shí)間有所延遲，但是形態(tài)學(xué)上沒有很明顯的變化，可能的原因是這兩個(gè)時(shí)期細(xì)胞主要進(jìn)行內(nèi)陷、外包等運(yùn)動(dòng)行為[18]。當(dāng)胚胎發(fā)育進(jìn)入成體節(jié)期時(shí)，由于這個(gè)時(shí)期脊索和神經(jīng)管正在形成，因此外界有毒物質(zhì)的存在將導(dǎo)致脊椎畸形和神經(jīng)管形成障礙，具有這類缺陷的胚胎或者不能孵化出來，或者攜帶各種缺陷孵化出來，主要表現(xiàn)為尾部彎曲、短缺或卵黃囊腫大等畸形。本研究預(yù)試驗(yàn)對(duì)受精卵直接染毒并修復(fù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)受精后馬上染毒的胚胎沒有明顯的修復(fù)作用，故正式試驗(yàn)所用的胚胎材料為受精后約24～26 h的尾芽期胚胎。此期胚胎的早期器官雛形已經(jīng)形成，在解剖鏡下可見初步的大腦已分化，眼囊清晰可見，胚體尾部呈圓錐狀尾芽，尾鰭和體節(jié)等尚未完全形成，因此這個(gè)時(shí)期的胚胎在接觸NP后，僅對(duì)脊椎和體節(jié)的形成造成障礙，導(dǎo)致胚胎孵化率的降低及各種尾部畸形增多。

許多研究認(rèn)為NP對(duì)生物體的毒害與NP誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過量氧自由基有關(guān)[19-25]，而茶多酚諸多的生物學(xué)功能中，清除自由基、抗氧化能力尤為突出。因此本試驗(yàn)在NP基礎(chǔ)液中加入適量茶多酚后能顯著提高白鯽魚胚胎的孵化率，并降低孵化仔魚的畸形率，這可能與低濃度茶多酚改善胚胎的氧化損傷有關(guān)[26-31]。

4 結(jié)論

NP對(duì)白鯽魚胚胎具有一定的發(fā)育毒性，不僅導(dǎo)致胚胎孵化率降低，而且引起孵化仔魚畸形率增加，而在NP中添加適量的茶多酚能改善NP引發(fā)的白鯽魚胚胎發(fā)育毒性，使得胚胎孵化率增加，孵化仔魚畸形率下降。