郭耀東，任嘉瑜，胡莎莎

(1.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院，陜西商洛 726000；2.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000)

萬壽菊(Tagetesspp.)為菊科萬壽菊屬、1a生草本植物，花色鮮艷并富含葉黃素、多酚、黃酮等多種生物活性物質(zhì)[1-3]。具有較強的觀賞價值、藥用價值和經(jīng)濟價值[2,4-6]。近年來，隨著中國各地大力實施產(chǎn)業(yè)扶貧和鄉(xiāng)鎮(zhèn)振興戰(zhàn)略，萬壽菊種植面積和產(chǎn)量不斷擴大。由此形成的萬壽菊加工業(yè)也已成為帶動地方經(jīng)濟發(fā)展、實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)脫貧的支柱產(chǎn)業(yè)。目前萬壽菊加工主要以發(fā)酵、干燥、制備萬壽菊顆粒，提取脂溶性葉黃素為主，提取工藝主要為有機溶劑浸提[7]、酶法輔助提取[8]以及超臨界CO2輔助提取[9]等。亞臨界提取技術(shù)以提取溫度低、效率高、生物活性成分損失少并易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點，已成為萬壽菊葉黃素提取制備的主要工藝[10-11]。

萬壽菊提取制備葉黃素后的副產(chǎn)物-萬壽菊殘渣中仍含有較為豐富的多酚、黃酮等水溶性活性物質(zhì)，具有較好的開發(fā)利用價值[3,12]。本研究以亞臨界提取葉黃素后的萬壽菊殘渣為研究對象，利用超聲波輔助提取技術(shù)，通過單因素試驗和響應(yīng)面分析，對超聲波提取萬壽菊殘渣中多酚和黃酮工藝進行優(yōu)化，獲得萬壽菊殘渣多酚、黃酮最優(yōu)提取工藝，為實現(xiàn)萬壽菊資源多元化綜合利用、提升整個產(chǎn)業(yè)鏈附加值提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料和試劑

亞臨界提取葉黃素后萬壽菊殘渣，由陜西森弗天然制品有限公司提供。蘆丁、沒食子酸標(biāo)品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、鹽酸等均為分析純，購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

750T型多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；ME204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UPR-HW-40L型超純水機，優(yōu)普儀器設(shè)備公司；KQ-500D型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度、提取功率、提取次數(shù)為單因素，分析超聲波輔助各因素對萬壽菊殘渣多酚、黃酮提取效果的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱取干燥并粉碎后的萬壽菊殘渣 5.0 g，在料液比1∶10(g/mL)、超聲功率200 W、50 ℃條件下，分別用體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液提取30 min。

料液比：稱取干燥并粉碎后的萬壽菊殘渣 5.0 g，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶5、1∶15、1∶25、 1∶35、1∶45(g/mL)，在超聲功率200 W、50 ℃條件下，用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液提取 30 min。

提取時間：稱取干燥并粉碎后的萬壽菊殘渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、超聲功率200 W、50 ℃條件下，用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液分別提取15、30、45、60和75 min。

提取溫度：稱取干燥并粉碎后的萬壽菊殘渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、超聲功率200 W條件下，分別用80%乙醇溶液在30、40、50、60、70和80 ℃下提取45 min。

提取功率：稱取干燥并粉碎后的萬壽菊殘渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、50 ℃下，用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液分別在超聲功率為100、200、300、400和500 W時提取45 min。

提取次數(shù)：稱取干燥并粉碎后的萬壽菊殘渣5.0 g，在料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W、50 ℃條件下，用80%乙醇溶液提取45 min。分別提取1次、2次和3次。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定料液比1∶35(g/mL)、超聲波功率300 W、提取次數(shù)1次，選取提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間3個因素，每個因素設(shè)置3個水平，利用Design-ExpertV 8.0進行Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗[13]。因素水平如表1。

表1 萬壽菊殘渣中多酚和黃酮提取Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design for polyphenols and flavonoids extraction

1.4 測定項目及方法

多酚提取率：在張村雪等[14]建立的方法基礎(chǔ)上，略有改動，測定樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取沒食子酸分析標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用水溶解定容至100 mL，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入福林酚2.0 mL和Na2CO3溶液(75 mg/mL)2.0 mL，定容至10 mL搖勻后放置2 h顯色，765 nm下測定吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，765 nm下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程：y=123.27x+0.033 5，R2=0.998 1。將樣品提取液稀釋不同倍數(shù)后，吸取100 μL置于10 mL容量瓶中，按上述方法分別測定吸光度，代入回歸方程計算樣品中多酚提取率，計算過程中考慮不同稀釋倍數(shù)。

黃酮提取率：在張村雪等[14]建立的方法基礎(chǔ)上，略有改動，測定樣品中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用水定容至50 mL，分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶，加入NaNO2溶液(50 mg/mL)0.5 mL，放置 6 min后加入Al(NO3)3溶液(100 mg/mL)0.5 mL，放置6 min后再加入NaOH溶液(40 mg/mL)4 mL，加水定容至10 mL，15 min后于510 nm下測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度 (mg/mL)為橫坐標(biāo)，510 nm下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程：y= 12.494x-0.012，R2=0.999 4。將樣品提取液稀釋不同倍數(shù)后，吸取1 mL置于10 mL容量瓶中，按前述方法測定吸光度，代入回歸方程計算樣品中黃酮提取率，計算過程中考慮不同稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 超聲波輔助提取萬壽菊殘渣多酚和黃酮單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖1可知，萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取率均隨提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時提取率最高，之后多酚和黃酮提取率有所下降。主要原因為通過調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)使提取溶劑極性發(fā)生變化。根據(jù)相似相溶原理，提取溶劑與目標(biāo)提取物質(zhì)極性接近時，有利于目標(biāo)提取物質(zhì)溶出，提取效果更佳[15-16]。因此，選定提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%進行后續(xù)試驗。

2.1.2 料液比 由圖2可知，在料液比為1∶35(g/mL)以前，萬壽菊殘渣多酚、黃酮提取率均隨料液比減小而升高。其原因為隨著提取溶劑用量增大，萬壽菊殘渣顆粒與提取溶劑之間接觸面積增加，有利于多酚和黃酮兩類提取目標(biāo)物質(zhì)向溶劑中轉(zhuǎn)移擴散，使提取率升高[17-18]。當(dāng)液料比達到1∶35(g/mL)時，提取率達到最高，此后，隨著料液比減小，多酚、黃酮提取率均有所下降。同時從成本角度分析，提取溶劑用量越多，成本越高。因此，選擇料液比1∶35(g/mL)進行后續(xù)試驗。

圖1 提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)對萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取效果的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenol and flavonoid from marigold residues

圖2 料液比對萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取效果的影響Fig.2 Effects of solid-to-liquid ratio on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.1.3 提取時間 由圖3可知，萬壽菊殘渣中多酚和黃酮提取率均先隨提取時間增加而升高，當(dāng)提取時間達到45 min時提取率最高，此后，隨著提取時間增加，多酚、黃酮提取率均有所下降。其原因可能為隨著提取時間增加，在較高溫度下，多酚和黃酮受超聲波空化效應(yīng)影響在一定程度上分解，導(dǎo)致提取率下降[16,19]。因此，選擇提取時間45 min進行后續(xù)試驗。

2.1.4 提取溫度 由圖4可知，萬壽菊殘渣中多酚和黃酮提取率均隨提取溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。30～50 ℃時，多酚、黃酮提取率隨提取溫度上升而逐漸升高，在50 ℃時達到最大，此后，提取率隨提取溫度上升有所下降。其原因可能為多酚、黃酮類等生物活性物質(zhì)對溫度較為敏感，在較高溫度下有一定程度分解，導(dǎo)致提取率下降[20-21]。因此，選擇提取溫度50 ℃進行后續(xù) 試驗。

圖3 提取時間對萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取效果的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of polyphenol and flavonoid from marigold residues

圖4 提取溫度對萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取效果的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment temperature on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.1.5 超聲功率 由圖5可知，萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取率均隨超聲功率增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在超聲功率為100～300 W，多酚、黃酮提取率隨超聲功率增大而逐漸提升，當(dāng)超聲功率達到300 W時提取率最高，此后，提取率隨超聲功率增大而有所下降。其原因可能為功率增大使超聲波空化作用增強而促進多酚和黃酮有效溶出，但功率過大又會造成多酚、黃酮分解，使提取率降低。因此，選擇超聲功率300 W進行后續(xù)試驗[19-20,22]。

圖5 超聲功率對萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.1.6 提取次數(shù) 由圖6可知，提取次數(shù)為1次、2次和3次時，萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取率差異很小。說明一次提取已能充分提取萬壽菊殘渣中多酚和黃酮。從成本角度分析，提取次數(shù)越多成本越高。因此，選擇1次提取進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖6 提取次數(shù)對萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取效果的影響Fig.6 Effects of extraction times on extraction rate of polyphenols and flavonoids from marigold residues

2.2 超聲波輔助提取萬壽菊殘渣多酚和黃酮響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對萬壽菊殘渣多酚、黃酮提取效果影響較為明顯的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時間和提取溫度3個因素，進行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 超聲波提取萬壽菊殘渣多酚黃酮響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis for polyphenols and flavonoids extraction from marigold residues

2.2.2 多酚提取響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析及交互作用影響 對表2中萬壽菊殘渣多酚提取結(jié)果進行分析，建立回歸方程:Y=-1 861.905 0+ 39.119 0A+9.162 8B+16.684 3C+0.006 2AB- 0.008 8AC-0.034 4BC-0.239 2A2- 0.081 2B2- 0.150 5C2。Y為多酚提取率，A為提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)，B為提取時間，C為提取溫度。

超聲波提取萬壽菊殘渣多酚響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果如表3所示，不同因素交互作用對多酚提取率影響如圖7所示。由表3可知，所建立的方程模型具有高度顯著性(P<0.000 1)。失擬項不顯著(P=0.064 1>0.05)，擬合程度較好(R2=0.994 5，AdjR2=0.987 4)，可以較好反映多酚提取率與提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度之間關(guān)系，用于優(yōu)化萬壽菊殘渣多酚提取。不同因素中，A、B、A2、B2、C2對萬壽菊殘渣多酚提取率具有極顯著影響(P<0.01)，C對萬壽菊殘渣多酚提取率具有顯著影響(P<0.05)，3個因素之間交互作用對多酚提取率影響均不顯著(P>0.05)，說明響應(yīng)面優(yōu)化試驗所選取的3個因素之間交互作用對多酚提取率影響較弱。

根據(jù)建立的回歸方程，在選取因素范圍內(nèi)，得到超聲波提取萬壽菊殘渣多酚最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)81.54%，提取時間49.49 min，溫度47.39 ℃，在此條件下得到的多酚理論提取率為354.86 mg/g。

表3 超聲波提取萬壽菊殘渣多酚響應(yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted regression model for polyphenols extraction from marigold residues

注：**表示差異極顯著，*表示差異顯著。下同。

Note:** show extremly significant difference,* significant difference.The same below.

圖7 不同因素對萬壽菊殘渣多酚提取效果交互作用影響Fig.7 Response surface plots for interaction effects of different factors on extraction rate of polyphenols from marigold residues

2.2.3 黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析及交互作用影響 對表2中萬壽菊殘渣黃酮提取結(jié)果進行分析，建立回歸方程:Y=-481.525 0+ 5.957 5A+8.880 5B+9.440 8C+0.010 6AB+ 0.000 7AC-0.008 1BC-0.041 0A2- 0.093 5B2-0.090 3C2。Y為黃酮提取率，A為提取液乙醇濃度體積分?jǐn)?shù)，B為提取時間，C為提取溫度。

超聲波提取萬壽菊殘渣黃酮響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果如表4所示，不同因素交互作用對黃酮提取率影響如圖8所示。由表4可知，所建立的方程模型具有高度顯著性(P< 0.000 1)。失擬項不顯著(P=0.154 6>0.05)，擬合程度較好(R2=0.990 3，AdjR2=0.977 8)，可以較好反映黃酮提取率與提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度之間關(guān)系，用于優(yōu)化萬壽菊殘渣黃酮提取。不同因素中，B、A2、B2、C2對萬壽菊殘渣黃酮提取率具有極顯著影響(P<0.01)，3個因素之間交互作用對黃酮提取率影響均不顯著(P>0.05)，說明響應(yīng)面優(yōu)化試驗所選取的3個因素之間交互作用對黃酮提取率影響較弱。

根據(jù)建立的回歸方程，在選取因素范圍內(nèi)，得到超聲波提取萬壽菊殘渣黃酮最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)79.46%、提取時間49.81 min、溫度50.33 ℃，在此條件下得到的黃酮理論提取率為 214.01 mg/g。

表4 超聲波提取萬壽菊殘渣黃酮響應(yīng)面回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for fitted regression model for flavonoid extraction from marigold residues

圖8 不同因素對萬壽菊殘渣黃酮提取效果交互作用影響Fig.8 Response surface plots for interaction effects of different factors on extraction rate of flavonoids from marigold residues

2.2.4 多酚和黃酮最優(yōu)工藝參數(shù)確定 以多酚、黃酮提取率最大化為目標(biāo)，對萬壽菊殘渣多酚、黃酮提取結(jié)果進行綜合分析。并考慮提取工藝實際可操作性，對前述得到萬壽菊殘渣多酚、黃酮類物質(zhì)最優(yōu)工藝參數(shù)進行修正，按照乙醇體積分?jǐn)?shù)為81%、提取時間50 min、提取溫度49 ℃的條件進行5次平行驗證性試驗。最終多酚平均提取率為356.67 mg/g、黃酮平均提取率為216.04 mg/g，與理論提取率接近。證明本研究建立的萬壽菊殘渣提取多酚、黃酮回歸模型的有效性。

3 結(jié)論與展望

本研究以亞臨界提取制備葉黃素后的副產(chǎn)物萬壽菊殘渣為原料，利用超聲波輔助提取技術(shù)，通過單因素試驗和Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到多酚和黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)81%、提取時間50 min、提取溫度49 ℃、料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W。在此條件下，萬壽菊殘渣多酚和黃酮提取率分別為 356.67 mg/g和216.04 mg/g，能夠提取得到絕大多數(shù)的多酚、黃酮等水溶性生物活性物質(zhì)。

本研究優(yōu)化得到的萬壽菊殘渣中多酚、黃酮提取率相對其他文獻較高，其原因可能為本研究所用原料為亞臨界提取制備葉黃素后的殘渣[23]。一方面，亞臨界萃取對脂溶性物質(zhì)具有良好的提取效果，使萬壽菊顆粒中葉黃素等脂溶性物質(zhì)能夠最大限度浸出，剩余水溶性活性物質(zhì)更加富集[24]。另一方面，亞臨界對提取基質(zhì)具有較好的粉碎孔化作用，能夠在一定程度上促進提高活性物質(zhì)的提取分離效率[24]。研究結(jié)果說明亞臨界提取葉黃素后的萬壽菊殘渣中含有豐富的多酚、黃酮等水溶性生物活性物質(zhì)，具有廣闊的開發(fā)利用前景和價值。

萬壽菊植物多酚、黃酮類成分復(fù)雜、種類多樣，且二者在較大程度上交叉存在[5,25-26]。本研究團隊下一步將在此基礎(chǔ)上，對萬壽菊殘渣中多酚、黃酮類物質(zhì)進一步分離、純化、鑒定，探究并闡明多酚、黃酮類物質(zhì)的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成。