王丹丹，陳子乾，王 星

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118003)

紅光熊蜂(BombusignitesSmith)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)熊蜂屬(Bombus)，是一類重要的本土傳粉昆蟲，分布在黑龍江、遼寧、甘肅、河北、山西和云南等地，其在保持生物多樣性及維持生態(tài)系統(tǒng)平衡方面尤為重要[1]。熊蜂吻喙長，訪花過程中接觸柱頭頻率較高，對低溫、弱光、高濕環(huán)境的適應(yīng)力顯著高于蜜蜂，能抵抗惡劣環(huán)境、日工作時(shí)間及單花訪問時(shí)間較長，且熊蜂沒有蜜蜂敏銳的信息交流系統(tǒng)，可專心于溫室作物授粉，不僅能提高坐果率和產(chǎn)量，改善果實(shí)籽粒品質(zhì)，亦可避免使用植物生長調(diào)節(jié)劑處理花朵帶來的激素污染。所以，熊蜂是溫室作物尤其是茄科植物的理想授粉者[2]。

化學(xué)感受器是熊蜂與外界環(huán)境及其他個(gè)體交流的關(guān)鍵，對昆蟲的社會行為至關(guān)重要，可介導(dǎo)個(gè)體對周圍環(huán)境中化學(xué)信號的檢測，嗅覺可使器官識別環(huán)境中的不同氣味，尋找食物、配偶、生存與繁殖場所以及辨別食物、同伴與天敵，躲避外界環(huán)境的傷害[3-5]。味覺可辨別可溶性激素，激發(fā)先天交配行為；參與化學(xué)信號識別的重要蛋白包括各種不同大小的基因家族，其中化學(xué)感受器受體超家族至關(guān)重要，由氣味受體(odorant receptors, ORs)、味覺受體(gustatory receptors, GRs)以及離子受體(ionotropic receptors, IRs)共同構(gòu)成，其中ORs是嗅覺識別過程中的關(guān)鍵成分之一。昆蟲的氣味受體包括普通氣味受體(ORs)與氣味共受體(Orco)兩類。ORs在不同昆蟲中是高度分化的，而昆蟲的Orco只有一種且高度保守[6-9]。

本試驗(yàn)以紅光熊蜂為研究對象，采用掃描電鏡對紅光熊蜂觸角感受器進(jìn)行觀察；以RT-PCR技術(shù)獲得BiOr119的cDNA序列，克隆氣味受體基因BiOr119，采用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測其氨基酸結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性，構(gòu)建氨基酸同源性系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析紅光熊蜂氣味受體基因BiOr119在工蜂不同發(fā)育階段、不同組織中的表達(dá)情況，推測BiOr119在紅光熊蜂嗅覺識別過程中發(fā)揮的重要作用，為進(jìn)一步研究紅光熊蜂氣味受體基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用紅光熊蜂為遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院蜜蜂研究所繁育，飼養(yǎng)溫度28 ℃±0.5 ℃，濕度50%±5%，無光照。取繁育旺盛，健康無病蜂群中的紅光熊蜂工蜂作為試驗(yàn)材料，剛羽化出蜂房的工蜂標(biāo)記為1日齡，而后每5 d用無毒無味的油漆標(biāo)記1次，隨后分別在1、5、10、15、20、25、30日齡采樣，每次每群各取30頭，標(biāo)記后放入蜂群中[10-11]。

1.2 觸角感受器電鏡掃描

將紅光熊蜂觸角取下浸泡在φ=2.5%戊二醛中固定24 h，超聲波清理觸角后，置于碘化鉀組織導(dǎo)電液中8 h，用蒸餾水清洗后，采用叔丁醇脫水、干燥[12]，以備日立S4800型場發(fā)射掃描電鏡拍照觀察。

1.3 總RNA提取

采樣各日齡紅光熊蜂30頭帶回實(shí)驗(yàn)室分離各組織，低溫麻醉后用眼科鑷剝離其完整觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、足和翅，迅速放入盛有液氮的研缽中，研磨至粉末狀倒入RNA-free的1.5 mL Trizol(4 ℃)EP管中，-80 ℃保存，以備RNA提取[13]。試驗(yàn)于2018年5-6月于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，此時(shí)為自然界蜜粉源充足時(shí)期。

按照Takara公司總RNA微量提取試劑盒操作步驟提取工蜂各組織總RNA，并檢測RNA完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix perfect Real Time，以總RNA為模板，Oligo-dT為引物，合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存，備用。上述藥品均購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上已報(bào)道的地熊蜂(Bombusterrestris)的氣味受體基因BtOr9a(登錄號：NC_015772.1)設(shè)計(jì)特異性克隆引物(premier 5.0)[14]，用于擴(kuò)增紅光熊蜂氣味受體基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)，采用DANMAN、ClustalW、BlastP等在線軟件找出開放閱讀框(ORF)區(qū)域，并設(shè)計(jì)特異性引物用于熒光定量qPCR，熊蜂β-actin為內(nèi)參基因 (表1)。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.5 紅光熊蜂氣味受體基因 BiOr119克隆與測序

以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 14 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.5 μL，200 U/mLTaqDNA polymerase 0.5 μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，cDNA模板 2 μL； PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存[15-16]。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶、雙向測序(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.6 生物信息學(xué)分析

采用DNAStar軟件中的SepMan對紅光熊蜂基因BiOr119序列進(jìn)行拼接，獲得BiOr119的cDNA序列；采用在線軟件ORF Finder 搜索該序列的開放閱讀框(ORF)，DNAMAN軟件預(yù)測其氨基酸序列，使用NCBI中BlastP進(jìn)行氨基酸同源序列分析；采用MEGA7.0軟件鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.7 紅光熊蜂 BiOr119基因表達(dá)量分析

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

以不同日齡工蜂各組織cDNA為模板，qPCR分析BiOr119各組織差異表達(dá)量，分別取3份樣品，在同等條件下擴(kuò)增，每份樣品平均做3個(gè)平行試驗(yàn)，作為生物學(xué)重復(fù)，分析其組內(nèi)及組間差異，以檢測該熒光定量qPCR方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性[19]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用MxPro Excel比較紅光熊蜂BiOr119在工蜂羽化后的不同組織、不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量；以SPSS 19.0軟件中單因素ANOVA方法進(jìn)行方差分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光熊蜂觸角感受器電鏡圖

經(jīng)掃描電鏡觀察紅光熊蜂工蜂觸角感受器(圖1)，可見工蜂觸角上具4種感受器，構(gòu)成熊蜂主要的嗅覺器官，以板型感受器和刺狀感受器為主，仍具毛狀感受器和腔型感受器；板型感受器呈橢圓形的盤狀結(jié)構(gòu)，表面具數(shù)個(gè)大小不一的突起，在工蜂觸角上分布緊密，覆蓋在鞭節(jié)表面，板型感受器周圍遍布錐狀感受器，短粗的釘狀，著生于臼狀窩內(nèi)；毛型感受器頂端略彎，基部從觸角表皮上的鞘狀結(jié)構(gòu)延伸出來，向頂端生長；腔型感受器在觸角上分布較少，由表皮向內(nèi)凹陷形成，且凹陷區(qū)中間有不規(guī)則的鋸齒結(jié)構(gòu)。

2.2 紅光熊蜂 BiOr119基因的克隆與測序

采用DNAstar軟件中的SeqMan程序拼接克隆的特異性產(chǎn)物，搜索該基因完整的ORF，得到BiOr119基因序列長度為1077bp，共編碼358個(gè)氨基酸(圖2)。NCBI保守結(jié)構(gòu)域在線分析表明，BiOr119基因編碼的氨基酸在28～339位具有一個(gè)昆蟲氣味受體家族的保守結(jié)構(gòu)域7tm-6 superfamily(E-value：2.45e-07)，蛋白具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于52～81、106～139、 154～180、216～239、262～282、318～348位氨基酸之間、且蛋白氨基端位于膜內(nèi)(圖3)。

A. 熊蜂觸角背面觀(30 μm) The dorsal view ofBombusignitesantenna (30 μm)； B.熊蜂觸角腹面觀(30 μm) The ventral view ofBombusignitesantenna (30 μm) ；C. 熊蜂觸角背面觀(10 μm) The dorsal view ofBombusignitesantenna (10 μm)；D. 熊蜂觸角腹面觀(10 μm) The ventral view ofBombusignitesantenna (10 μm)；1.板型感受器 Sensilla coeloconica；2.錐狀感受器 Sensilla basiconica；3.毛狀感受器 Sensilla trichodea；4.腔型感受器 Sensilla basiconica

圖1 紅光熊蜂觸角感受器掃描電鏡圖照片
Fig.1 The SEM photos of antennal sensilla ofBombusignites

基因序列長度為1 077 bp，最大開放閱讀框共編碼358個(gè)氨基酸(1 074 bp)分子質(zhì)量為41.413 ku；6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)榧t色下劃線標(biāo)注 The length of the gene sequence is 1 077 bp, the maximum open reading frame encodes a total of 358 amino acids (1 074 bp) with a molecular mass of 41.413 ku; the six transmembrane domains were underlined in red.

圖2 紅光熊蜂BiOr119基因cDNA核苷酸序列及其翻譯的氨基酸序列
Fig.2 Nucleartide and translated amino acid sequences ofBiOr119cDNA ofBombusignites

圖3 紅光熊蜂 BiOr119基因預(yù)測的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.3 Prediction of transmembrane structure of BiOr119 of Bombus ignites

2.3 紅光熊蜂 BiOr119基因結(jié)構(gòu)與理化分析

采用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測BiOr119蛋白質(zhì)分子式C1906H2965N459O521S26，分子質(zhì)量為41.48 ku，理論等電點(diǎn)(pI)7.04，偏堿性；在BiOr119蛋白質(zhì)的氨基酸組成中苯丙氨酸(Ile)所占比例最高 11.5%，色氨酸(Trp)最低1.4%；帶正電荷的氨基酸殘基(Arg + Lys)與帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp + Glu)均為32，說明該蛋白不帶電。BiOr119蛋白質(zhì)的平均親水系數(shù)0.347，不穩(wěn)定性指數(shù)39.98，脂溶性指數(shù)111.84，表明BiOr119是一種穩(wěn)定的疏水性蛋白。

2.4 紅光熊蜂BiOr119聚類分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中將BiOr119預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行BlastP比對分析，得到與BiOr119序列一致性較高的地熊蜂BtOr9a(96.2%)，其他與BiOr119具有同源性的氨基酸序列分別為膜翅目蟻屬、蜜蜂屬和熊蜂屬，氨基酸序列同源性為35%～85%，采用MEGA7.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，共分為3支，第1支為蟻屬紅色收獲蟻；第2支為中華蜜蜂Apisceranacerana、西方蜜蜂Apismellifera和大蜜蜂Apisdorsata；第3支為蘭州熊蜂Bombuslantschouensis、地熊蜂Bombusterrestris和紅光熊蜂Bombusignites。

2.5 紅光熊蜂 BiOr119基因的相對表達(dá)量分析

采用qPCR技術(shù)分析紅光熊蜂工蜂1、5、10、15、20、25和30日齡不同組織中BiOr119基因的表達(dá)量，以10日齡工蜂頭部BiOr119基因表達(dá)量為相對基準(zhǔn)量。結(jié)果顯示(圖5)，BiOr119基因的表達(dá)量隨日齡變化在不同組織中差異較為顯著，觸角中BiOr119基因的表達(dá)量在各日齡工蜂中最高，并極顯著高于其他各組織(P<0.01)，BiOr119基因在1日齡觸角中的表達(dá)量較低，隨后緩慢增加，至15日齡驟然下降，后回升至25日齡時(shí)達(dá)到峰值，隨后趨于下降趨勢；而在腹部的表達(dá)量最低，約為相應(yīng)日齡工蜂觸角表達(dá)量的 299～759倍，可見，觸角在紅光熊蜂嗅覺識別過程中起著主要作用，是其較為重要的嗅覺器官。

蛋白質(zhì)：PbrOr9a-like：紅色收獲蟻Pogonomyrmexbarbatus，XP_011643586.1；AcerOr113：中華蜜蜂Apisceranacerana，ALP_75639.1；AmelOr109：西方蜜蜂Apismellifera，NP_001229917.1；AdorOr1-like：大蜜蜂Apisdorsata，XP_006608961.1；BlOr162：蘭州熊蜂Bombuslantschouensis，KX_270974.1；BlOr66：蘭州熊蜂Bombuslantschouensis，MK_061344.1；BtOr9a：地熊蜂Bombusterrestris，NC_015772.1； BiOr119：紅光熊蜂Bombusignites；BtOr22c：地熊蜂Bombusterrestris，XM_012312228.1；BtOr13a：地熊蜂Bombusterrestris，XM_0123091122

Amino acid:PbrOr9a-likePogonomyrmexbarbatus，XP_011643586.1; AcerOr113Apisceranacerana, ALP_75639.1; AmelOr109:Apismellifera, NP_001229917.1; AdorOr1-like:Apisdorsata, XP_006608961.1; BlOr162:Bombuslantschouensis, KX_270974.1; BlOr66:Bombuslantschouensis, MK_061344.1; BtOr9a:Bombusterrestris, NC_015772.1;BiOr119:Bombusignites; BtOr22c:Bombusterrestris, XM_012312228.1; BtOr13a:Bombusterrestris, XM_0123091122

圖4 基于BiOr119氨基酸序列構(gòu)建的Ors基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)
Fig.4 Phylogenetic tree of Ors based on amino acid sequences of BiOr119 with neighbor-joining method

3 討 論

嗅覺是熊蜂對周圍環(huán)境中揮發(fā)性物質(zhì)的感受過程。熊蜂觸角含有大量嗅覺感受器，對其覓食、求偶、繁殖、躲避敵害等行為尤為重要。熊蜂對外界氣味分子的識別是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，有多種蛋白參與，即氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBPs)、氣味受體、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(Sensory neuron membrane protein, SNMPs)以及氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)等[21]。每個(gè)嗅覺感受器內(nèi)均含有多條嗅覺感受神經(jīng)元，外界氣味分子先與氣味結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，后穿過淋巴液到達(dá)氣味受體，氣味受體受到刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位形成嗅覺信號，嗅覺信號通過嗅覺神經(jīng)元傳遞到腦部的觸角葉結(jié)構(gòu)，最終獲得氣味分子的抽象信息，從而指導(dǎo)昆蟲的各種行為。氣味受體(Ors)是熊蜂嗅覺生理過程中重要的參與者，大部分Ors具有典型的結(jié)構(gòu)7tm-6 superfamily，即：7次跨膜結(jié)構(gòu)域的受體蛋白，其氣味受體蛋白的N端在細(xì)胞膜內(nèi)，C端在細(xì)胞外，這點(diǎn)與脊椎動(dòng)物嗅覺受體的G蛋白偶聯(lián)受體不同，該受體具有感知和傳輸氣味的功能，紅光熊蜂 BiOr119蛋白質(zhì)呈堿性，不帶電，為僅具6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域疏水性蛋白，與小菜蛾P(guān)xylOr18[22]，中華蜜蜂AcerOr1和AcerOr3推測的結(jié)果一致[23]；此外，通過NCBI氨基酸序列同源性比對分析，顯示BiOr119與膜翅目熊蜂屬及蜜蜂屬部分昆蟲的氣味受體具有較高的同源性，與地熊蜂BtOr9a同源性高達(dá)96.2%，推測可能是由同一基因分化而來，而與蟻屬或膜翅目其他屬則表現(xiàn)出較低的同源性，說明不同種類的昆蟲，由于對不同氣味分子的信息素感知具有專一性，而導(dǎo)致其氣味受體基因具有高度的變異。綜上所述，紅光熊蜂BiOr119符合昆蟲氣味受體結(jié)構(gòu)特征。

基因表達(dá)量以10日齡紅光熊蜂工蜂頭部的表達(dá)量為基準(zhǔn)；圖中數(shù)據(jù)表示同一日齡工蜂不同組織間BiOr119的表達(dá)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)?！?*”表示差異極顯著(P<0.01)，“*”表示差異顯著(P<0.05)

The expression level of gene was normalized to that in the head of workers of 10-day-old.the data was expression level ofBiOr119in different day-old and different tissues ofBombusignites(mean±SE ).“**”the difference was statistically very significant (P<0.01) , “*”the difference was statistically significant (P<0.05)

圖5BiOr119基因在工蜂不同日齡、不同組織中的相對表達(dá)量
Fig.5 Relative expression level ofBiOr119in different day-old and different tissues ofBombusignites

紅光熊蜂是一種典型的社會性昆蟲，各群體分工明確，根據(jù)工蜂生理日齡分別承擔(dān)蜂巢內(nèi)外的工作，在18日齡以前為內(nèi)勤蜂，在巢內(nèi)保溫孵卵、蜜蠟造脾、飼喂幼蟲和蜂王及清理蜂房，18日齡以后工蜂日漸成熟，逐漸轉(zhuǎn)向巢外采集花粉、樹膠和水等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅光熊蜂BiOr119基因的表達(dá)量在15日驟降，推測15日齡為內(nèi)勤蜂轉(zhuǎn)為采集蜂的過渡階段，受到巢內(nèi)外環(huán)境、激素水平、腦部化學(xué)物質(zhì)及基因表達(dá)等諸多因素的影響，導(dǎo)致該氣味受體表達(dá)量較低，在25日齡后表達(dá)量有下降趨勢，可能是由于采集蜂工作10 d以上，其空間記憶、聯(lián)想學(xué)習(xí)能力明顯衰退，并伴隨著腦部蛋白質(zhì)與脂類的氧化損傷、突觸和生長相關(guān)蛋白神經(jīng)元的減退，死亡率增加[24-26]。