五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的影響

鄒 麗王秀秀錢 薇楊蘊(yùn)智葛 焱許正新

（1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225000；2.江蘇省重點(diǎn)動(dòng)物傳染病和人畜共患病預(yù)防控制共創(chuàng)中心，江蘇 揚(yáng)州225001；3.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225001；4.江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009）

五味子，木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，性味酸甘溫，具有寧心安神的功效，主治心神失養(yǎng)之虛煩心悸，失眠多夢(mèng)等癥狀。傳統(tǒng)中藥五味子以顯著的保肝作用而廣泛應(yīng)用于臨床［1-2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，五味子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)［3］、心腦血管系統(tǒng)［4-5］、免疫系統(tǒng)［6］亦有良好作用。劉菊秀等［7］的研究結(jié)果提示，適當(dāng)劑量的五味子具有減弱心收縮力，減慢心率的作用。成分分析結(jié)果顯示，五味子含揮發(fā)性成分、木脂素和有機(jī)酸等［8］。其中，屬于聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素類的五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）具有許多有應(yīng)用前景的藥理作用［9］。胡開永等［10］報(bào)道，五味子乙素對(duì)阿霉素引起的心肌毒性具有保護(hù)作用；孫紅霞等［11］研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注（I／R）損傷具有一定保護(hù)作用。眾所周知，藥物引起的心臟毒性、心臟缺血再灌注損傷等一系列作用的產(chǎn)生與離子通道密切相關(guān)，因此探索五味子乙素與離子通道之間的關(guān)系具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，探究五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞除極相的主要通道電流—鈉離子通道電流（INa）的影響。闡述五味子乙素與鈉通道有無關(guān)聯(lián)，并為其今后的開發(fā)利用及更好地服務(wù)于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠（250±20）g，雌雄不拘，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供 ［SCXK（蘇）2017-0044］。

1.2 試藥 五味子乙素（成都埃爾法生物科技有限公司，含有量為98%，批號(hào)405A096）；膠原酶Ⅱ（Worthington 公司，批號(hào)44N15308B）；肝素鈉（Solarbio 公司，批號(hào)301A028）；Glucose（Solarbio公司，批號(hào)405A096）；EGTA（Fluka 公司，批號(hào)101257840）；BSA（albumin from bovine serum，牛血清白蛋白，ICN 公司，批號(hào)8398F）；Taurine（?；撬幔琒igma 公司，批號(hào)101282014）；CsCl（Sigma 公司產(chǎn)品，批 號(hào) 101368097）；TEA-Cl（Sigma 公司，批號(hào)101394223）；MgATP（Sigma公司，批號(hào)1001571838）；HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸，Sigma 公司，批號(hào)1001621577）；TTX（Tetrodotoxin，河豚毒素，Affix 公 司，批 號(hào)AF02）；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 EPC-10 USB／Patchmaster 單通道膜片鉗放大器，德國(guó)Heka 公司；IX71倒置科研級(jí)顯微鏡，日本Olympus 公司；MP-225顯微操作器系統(tǒng)，美國(guó)Sutter 公司；P-97微電極拉制儀，美國(guó)Sutter公司；防震臺(tái)，美國(guó)TMC 公司；硼硅酸鹽玻璃電極（外徑1.5 mm，內(nèi)徑1.05 mm），武漢微探有限公司。

2 方法

2.1 溶液配制 臺(tái)氏液為NaCl 135 mmol／L，KCl 5.4 mmol／L，NaH2PO40.33 mmol／L，MgCl21.0 mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，CaCl21.8 mmol／L，Glucose 10.0 mmol／L，用NaOH 調(diào)pH 為7.30～7.40；無鈣臺(tái)氏液為臺(tái)式液除去CaCl2，即可；酶溶液為無鈣臺(tái)氏液中加入0.4 g／L 膠原酶Ⅱ，1 g／L 的BSA，0.4 g／L Taurine 和30 μmol CaCl2；KB 液 為L(zhǎng)glutamic acid 70.0 mmol／L，KCl 25.0 mmol／L，Taurine 10.0 mmol／L，NaH2PO410.0 mmol／L，EGTA 0.5 mmol／L，Glucose 11.0 mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，KOH 89.0 mmol／L，用KOH 調(diào)pH 為7.30～7.40；電極內(nèi)液為CsCl 133.0 mmol／L，NaCl 為5.0 mmol／L，TEACl 20.0 mmol／L，EGTA 10.0 mmol／L，HEPES 10.0 mmol／L，MgATP 5.0 mmol／L，用CsOH 調(diào)pH為7.25～7.30；細(xì)胞外液為NaCl 135.0 mmol／L，CsCl 5.4 mmol／L，MgCl21.0 mmol／L，CaCl21.8 mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，Glucose 10.0 mmol／L，CdCl20.1 mmol／L，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.30～7.40。

五味子乙素，以二甲基亞砜（DMSO）配制成100 μmol／L 的母液凍存，使用時(shí)用相應(yīng)的細(xì)胞外液分別稀釋成終濃度為1、2、3、10、30 μmol／L。

實(shí)驗(yàn)采用自身對(duì)照，按刺激方案引導(dǎo)、記錄五味子乙素灌流前INa（對(duì)照組），待電流穩(wěn)定后分別給予不同濃度的五味子乙素灌流，并記錄INa的變化。為最大化地減小因細(xì)胞大小帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，用電流密度表示電流值，單位pA／pF。

2.2 大鼠心室肌細(xì)胞的分離 大鼠心室肌細(xì)胞分離參照文獻(xiàn)并略作改善［12］。大鼠麻醉，仰臥位固定，開胸暴露心臟并于降主動(dòng)脈段快速將其剪下。排出殘血、稍作修剪后迅速將主動(dòng)脈插入改良過的Langendorff 灌注架上。0.4 g／L 膠原酶Ⅱ灌流消化20～30 min，直到心臟變軟、滴速變快、流出液渾濁并有粘稠感時(shí)停止消化，整個(gè)過程保持37 ℃并持續(xù)通氧。消化結(jié)束后取下心臟剪碎，用100目濾網(wǎng)過濾得到單個(gè)心室肌細(xì)胞，充氧半小時(shí)并室溫避光放置2～3 h 后即可用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn) 以P-97程序化水平拉制儀制備玻璃微電極，其尖端直徑約為1.5～2 μm。入液電阻保持在2～4 MΩ，串聯(lián)電阻補(bǔ)償為30%～50%。將細(xì)胞置于細(xì)胞外液中，靜置10 min，待貼壁后續(xù)以細(xì)胞外液灌流以除去殘存的KB 液。選用狀態(tài)良好、長(zhǎng)桿狀、邊緣光滑、完整、橫紋清晰、立體感強(qiáng)、無收縮的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用PatchMaster 軟件采集引導(dǎo)出的電流，用Origin7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并結(jié)合graphpad prism6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)［13］。當(dāng)膜電位保持在-80 mV，可以引導(dǎo)出一個(gè)內(nèi)向性電流，并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值。于細(xì)胞外液中加入Nav的特異性阻滯劑河豚毒素（10 μmol／L）后該電流明顯變小，用細(xì)胞外液灌流洗脫河豚毒素，此電流又得到一定程度的恢復(fù)。由此可以確定，在此刺激方案下面所引導(dǎo)出的電流即為INa，見圖1A。給予五味子乙素，觀察給藥10 min 后，圖1B 顯示，與對(duì)照組比較，3、10、30、100 μmol／L 五味子乙素對(duì)INa的作用顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），呈濃度依賴性，INa-Peak由給藥前的（-88.24 ± 6.93）pA／pF 依次降為（-77.07±6.17）、（-61.48±5.17）、（-47.78±3.69）、（-18.69±2.17）pA／pF。1、2 μmol／L 五味子乙素對(duì)INa無顯著差異，而五味子乙素在對(duì)阿霉素內(nèi)化作用時(shí)，IC50為 51.50 μmol／L，100 μmol／L五味子乙素可致細(xì)胞發(fā)生凋亡［14］。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，選擇了3、10、30 μmol／L 3個(gè)濃度。

圖1 不同濃度的五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響（n=6）Fig.1 Effects of different concentrations of Sch B on INaof rats ventricular myocytes（n=6）

3.2 五味子乙素對(duì)鈉通道電流-電壓關(guān)系（I-V）曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)［13］。記錄給予五味子乙素前后的INa，見圖2C，并以各刺激脈沖下引導(dǎo)出的INa電流密度（pA／pF）對(duì)應(yīng)相應(yīng)測(cè)試電壓繪制出鈉通道的I-V 曲線，見圖2A。由圖2A可見，10、30 μmol／L 五味子乙素可使鈉通道的IV 曲線顯著上移，但I(xiàn)-V 曲線的激活電位、峰電位及形態(tài)未發(fā)生改變，3 μmol／L 五味子乙素對(duì)I-V 曲線的影響不明顯。

圖2 五味子乙素對(duì)鈉通道I-V 曲線和INa激活曲線的影響（n=6）Fig.2 Effects of Sch B on the I-V and activation curve of INa（n=6）

3.3 五味子乙素對(duì)INa激活曲線的影響 INa的激活曲線原始數(shù)據(jù)由I-V 曲線的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化而來，并依Boltzmann 方程G／Gmax=1／ ｛1＋exp ［（V1／2-V）／k］｝ 進(jìn)行擬合得到穩(wěn)態(tài)激活曲線，見圖2B，縱坐標(biāo)為電導(dǎo)與最大電導(dǎo)的比值，橫坐標(biāo)為相應(yīng)的測(cè)試電壓。如圖2B 所示，3、10、30 μmol／L 五味子乙素可使激活曲線發(fā)生右移，V1／2-ac由給藥前的（-53.90±5.21）mV 分別變?yōu)椋?48.77±6.45）mV（P＞0.05）、（-43.69±5.34）mV、（-40.80±3.23）mV（P＜0.01），表明隨著五味子乙素濃度的增高，激活電壓相應(yīng)升高，鈉通道開啟的難度也逐漸增大。

3.4 五味子乙素對(duì)INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)［13］。給予雙脈沖刺激，分別記錄五味子乙素給藥前后INa的穩(wěn)態(tài)失活電流（圖3B），并按Boltzmann 方程I／Imax=1／ ｛1 ＋exp ［（VV1／2）／k］｝ 進(jìn)行擬合，繪制出INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線，見圖3A。從圖3A 可以看出，藥物可使INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線逐漸左移，表現(xiàn)為向超極化方向偏移。其中，3、10、30 μmol／L 五味子乙素使V1／2-in由給藥前的（-57.80 ± 6.21）mV 分別變?yōu)椋?64.70±7.55）mV（P＞0.05）、（-71.16±6.45）mV、（-81.03±7.53）mV（P＜0.01），k從給藥前（5.30±0.49）分別變?yōu)椋?.66±0.67）（P＞0.05）、（7.65±0.58）、（9.19±0.62）（P＜0.01）。因此，3 μmol／L五味子乙素對(duì)穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)影響不明顯，但10、30 μmol／L 五味子乙素可明顯改變INa的穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)特征，在穩(wěn)態(tài)失活狀態(tài)下通道開放靜息電位水平發(fā)生改變，加快INa的失活。

圖3 五味子乙素對(duì)INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響（n=6）Fig.3 Effects of Sch B on the inactivation curve of INa（n=6）

3.5 五味子乙素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)［13］。分別記錄五味子乙素給藥前后INa的失活后恢復(fù)電流，見圖4B，并通過用One-phase association 指數(shù)方程I／Imax=1-exp（-t／τ）進(jìn)行擬合，得到電流恢復(fù)曲線，縱坐標(biāo)為電流與最大電流的比值，橫坐標(biāo)為相對(duì)應(yīng)的時(shí)間，見圖4A。由圖4A 可見，3、10、30 μmol／L 五味子乙素能使INa的失活后恢復(fù)曲線逐漸右移，恢復(fù)時(shí)間常數(shù)τ由給藥前的（16.68±1.72）ms 變?yōu)椋?9.69±2.55）ms（P＞0.05）、（25.73 ± 2.93）ms 和（43.79±3.87）ms（P＜0.01）。可知，3 μmol／L 五味子乙素對(duì)失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)影響不明顯，但10、30 μmol／L 五味子乙素可明顯改變INa的失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征，使INa從失活態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變的時(shí)間延長(zhǎng)。

圖4 五味子乙素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響（n=6）Fig.4 Effects of Sch B on the curve of INarecovery from inactivation（n=6）

4 討論

離子通道的紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如常見的QT 綜合征、Brugada 綜合征、室性心動(dòng)過速等，此類疾病的發(fā)生都與心肌細(xì)胞上多種離子通道有關(guān)。而心肌細(xì)胞鈉離子電流為內(nèi)向電流，主要參與細(xì)胞動(dòng)作電位（AP）0相去極化過程，若鈉通道發(fā)生異常，則會(huì)使心肌細(xì)胞無法產(chǎn)生正常的AP，導(dǎo)致與鈉通道相關(guān)的離子通道疾病的發(fā)生［15］。

膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用為更為有效的觀察鈉電流動(dòng)力學(xué)特征提供了手段。實(shí)驗(yàn)中預(yù)觀察五味子乙素對(duì)鈉電流幾種常見動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。激活曲線用來解釋通道開放水平的難易程度，若曲線發(fā)生右移則提示激活電壓升高，通道開放難度增大。穩(wěn)態(tài)失活曲線常用來解釋通道滅活的電壓依賴性及藥物對(duì)通道滅活過程的影響，若藥物使其左移則表明藥物電壓依賴性的影響通道的滅活過程，提示該藥物可能與失活態(tài)鈉通道親和力高［16］。對(duì)于失活后恢復(fù)曲線，對(duì)其進(jìn)行擬合以求得恢復(fù)時(shí)間常數(shù)，時(shí)間常數(shù)越小則恢復(fù)的越快或藥物與通道分離的快，時(shí)間常數(shù)越大則分離的越慢。

五味子已廣泛應(yīng)用于臨床，現(xiàn)已證實(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)疾病亦有療效。成分之一的五味子乙素在心血管方面的研究備受關(guān)注，然而五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的研究尚少，對(duì)鈉通道的研究也是空白。因此，本研究根據(jù)有關(guān)報(bào)道的提示［17］，觀察不同濃度五味子乙素對(duì)SD 大鼠心室肌細(xì)胞INa峰值、I-V 曲線、失活和失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征的影響。結(jié)果表明，五味子乙素濃度大于3 μmol／L 能夠呈濃度依賴性地抑制INa，使I-V 曲線顯著上移，但曲線形態(tài)未發(fā)生改變，且五味子乙素在不同的膜電位水平下對(duì)INa的作用效果不同，提示五味子乙素對(duì)INa具有顯著的電壓依賴性；五味子乙素可使失活曲線顯著左移，可使恢復(fù)曲線顯著右移，進(jìn)一步加強(qiáng)了藥物對(duì)INa的抑制作用。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)五味子乙素對(duì)鈉通道的激活狀態(tài)、失活狀態(tài)，恢復(fù)狀態(tài)均有作用，共同結(jié)果就是增強(qiáng)了五味子乙素對(duì)鈉通道的抑制作用。因此，推測(cè)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)的五味子乙素具有的對(duì)抗心臟毒性、I／R 損傷等作用可能與其抑制INa有關(guān)。

此外，臨床上已將五味子用于心肌梗死、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)所致的心動(dòng)過速治療方劑中［18］；古方將五味子配炙甘草湯附加苦參、仙鶴草、丹參、黃芪、龍牡等用于治療心動(dòng)過速；五味子湯加味治療心律失常［19］等效果都十分顯著。然而這其中的作用機(jī)制還不是很明確，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為解釋五味子在其中發(fā)揮作用提供部分參考價(jià)值。此外，推測(cè)心臟鈉通道功能障礙的獲得性和遺傳性疾病例如Ⅲ型長(zhǎng)QT 綜合征，心房顫動(dòng)和擴(kuò)張型心肌病等，利用五味子乙素可通過糾正鈉通道功能異常從而對(duì)患者產(chǎn)生有益效果。

本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞鈉離子通道的作用，以此評(píng)估其對(duì)大鼠心臟電生理的影響。然而，對(duì)于其發(fā)揮心血管系統(tǒng)保護(hù)作用的具體調(diào)控機(jī)制還需要在其它通道、體內(nèi)過程及病理模型等方面做更全面的探討，為其在今后開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。