基于psbA-trnH基因序列的越桔屬植物鑒定研究

楊浩博， 王 瑜， 仲 帥， 劉 鑫， 宗成文

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

篤斯越桔(VacciniumuliginosumLinn.)，又稱都柿、篤斯、黑豆樹、龍果、地果等，杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生落葉灌木，是我國重要的野生漿果資源，主要分布于大、小興安嶺和長白山等地[1-2]。常呈大群落、成片集中分布，與落葉松、越桔、細(xì)葉杜香、蔓越桔等植物種混生[3]，具有耐酸性土壤、耐嚴(yán)寒的特性。篤斯越桔果實(shí)中含有較多營養(yǎng)成分，特別是有機(jī)酸、花青苷、黃酮類化合物等[4]，在提高大腦記憶、減少膽固醇累積、改善心血管機(jī)能、抗氧化活性、防止衰老等方面都具有較高的功效。篤斯越桔果實(shí)酸甜可口，營養(yǎng)豐富，除可鮮食外還可制果醬、釀酒等[5]。在篤斯越桔的遺傳多樣性研究方面，Alsos等[6]利用同工酶分析表明篤斯越桔種群內(nèi)部遺傳多樣性較低，在物種水平的遺傳多樣性較低。

DNA條形碼是利用一段標(biāo)準(zhǔn)分子片段對生物物種進(jìn)行識別和鑒定的一項(xiàng)新型技術(shù)，根據(jù)DNA信息，快速、準(zhǔn)確的識別某個(gè)物種或發(fā)現(xiàn)新物種以及隱存物種[7]。近些年來，國內(nèi)外學(xué)者對適合用于鑒定植物的 DNA條形碼基因序列進(jìn)行了積極的探索與研究，葉綠體psbA-trnH序列是位于psbA和trnH間的1段非編碼序列，與編碼區(qū)基因相比可提供更多的系統(tǒng)發(fā)育信息[8]。psbA-trnH基因片段進(jìn)化速率快，能夠積累較多變異，從而能夠鑒別親緣關(guān)系很近的物種，因此適宜作為鑒定植物的DNA條形碼。

張佳佳等[9]通過分析山藥28個(gè)不同樣品的psbA-trnH序列研究了山藥親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。李曉娟等[10]采用psbA-trnH序列對山東丹參、丹參 (S.miltiorrhiza) 和白花丹參 (S.miltiorrhizaf. alba) 共計(jì)33份材料進(jìn)行了研究，結(jié)果表明psbA-trnH基因間區(qū)可作為條形碼來鑒定山東丹參及其近緣種。萬如等[11]通過DNA條形碼技術(shù)，以psbA-trnH基因?yàn)闂l形碼編碼序列對枸杞屬植物21份試驗(yàn)材料進(jìn)行鑒定分析，在分子水平上獲得鑒定枸杞屬植物的理論依據(jù)。

我國越桔屬植物資源豐富，分布廣泛，對生態(tài)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，但缺少深入研究[12]，該試驗(yàn)以長白山地區(qū)與汪清地區(qū)的篤斯越桔為樣本，基于psbA-trnH序列與GenBank中其他越桔屬植物的psbA-trnH序列進(jìn)行差異分析，為進(jìn)一步研究篤越桔屬植物的遺傳進(jìn)化和分布奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以5份篤斯越桔葉片為樣本，其中，3份采自長白山東方紅林場(DNF_1-3)，經(jīng)度E128°25′60″，緯度N42°01′56″，海拔高度1 270 m，2份采自汪清蘭家林場(LJ_1-2)，經(jīng)度E130°49′52″，緯度N43°25′54″，海拔高度778 m，將新生嫩葉裝入標(biāo)記好的無菌采樣袋內(nèi)，再用干冰進(jìn)行低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入-60 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 篤斯越桔葉片DNA提取

使用北京華越洋生物技術(shù)有限公司的植物總DNA提取試劑盒，對篤斯越桔的新鮮葉片進(jìn)行DNA提取，DNA提取方法參照試劑盒中的植物總DNA提取說明書，檢測合格后保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

psbA-trnH引物序列：正向?yàn)?′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，反向?yàn)?′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′，psbA-trnH基因的PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：模板DNA1 μL(80 ng·L-1)；dNTP(2.5 mmol/L)1 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1 μL；rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL；10×Buffer 1 μL；ddH2O 19.8 μL。根據(jù)反應(yīng)體系設(shè)置如下擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s；然后72 ℃延伸5 min。最后擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃保存。

1.2.3 篤斯越桔psbA-trnH基因的克隆及測序

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀上觀察記錄，選取在預(yù)期目的基因條帶位置出現(xiàn)的單一清晰明亮條帶，利用北京華越洋DNA凝膠回收試劑盒純化回收目的條帶，與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，送至北京三博遠(yuǎn)志生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 篤斯越桔psbA-trnH基因的序列分析

將篤斯越桔psbA-trnH基因序列在NCBI的BLAST進(jìn)行比對，共下載11份越桔屬植物psbA-trnH序列，其中包括1份篤斯越桔，1份紅豆越桔，1份狹葉越桔，1份鹿莓越桔，1份烏飯樹，2份蔓越橘，2份草地越桔，2份歐洲越桔，使用ClustalX1.83軟件對越桔屬psbA-trnH基因序列進(jìn)行多序列比對，再使用GeneDoc軟件將多序列比對結(jié)果輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 篤斯越桔psbA-trnH基因片段的PCR擴(kuò)增與測序結(jié)果

以提取的的篤斯越桔總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在500 bp左右出現(xiàn)單一清晰明亮的擴(kuò)增條帶(圖1)，回收該條帶，送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序，結(jié)果顯示獲得了長度為477 bp的篤斯越桔psbA-trnH序列。產(chǎn)物序列與GeneBank的登錄號為GU361909的篤斯越桔長度相同。

圖1 篤斯越桔psbA-trnH PCR電泳檢測結(jié)果

2.2 越桔屬psbA-trnH基因的多序列比對及遺傳距離分析

2.2.1 越桔屬psbA-trnH基因的多序列比對

將試驗(yàn)材料測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)中篤斯越桔psbA-trnH基因與GeneBank中GU361908的歐洲越桔、GU361909的篤斯越桔、GU361911的紅豆越桔、GU361910的狹葉越桔、KP643387的鹿莓越桔和KP095224的烏飯樹的核苷酸序列一致性都達(dá)到了99%，與JQ757046.1的蔓越桔、KP095227的草地越桔和HF572793的歐洲越桔的核苷酸序列一致性達(dá)到了98%，與JQ248601的蔓越桔和KP095226的草地越桔的核苷酸序列一致性達(dá)到了97%，多序列比對結(jié)果如圖2所示。

通過多序列比對結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，篤斯越桔試驗(yàn)材料LJ_2在第143位點(diǎn)堿基為C，第359位點(diǎn)堿基為C，篤斯越桔試驗(yàn)材料DFH_2在第251位點(diǎn)堿基為C，篤斯越桔(GU361909)在第309位點(diǎn)堿基為C，說明篤斯越桔種內(nèi)存在一定的差異。

草地越桔共有3個(gè)有效鑒別位點(diǎn)，分別在第36堿基位的堿基為C，在第289堿基位插入了1段TATTCATTTTG堿基序列，在第398堿基位的堿基為T，蔓越桔共有2個(gè)有效鑒別位點(diǎn)，分別在第195堿基位的堿基為C，第339堿基位缺失1段TTGAAAATAA堿基序列，狹葉越桔共存在3個(gè)有效鑒別位點(diǎn)，分別在第8堿基位點(diǎn)缺失1個(gè)堿基，第169位點(diǎn)堿基為T，第428位點(diǎn)堿基為A，烏飯樹在第288堿基位為T，紅豆越桔在第236位堿基缺失，鹿莓越桔第305位點(diǎn)堿基為T。草地越桔與蔓越桔與其他越桔屬植物的堿基序列對比存在明顯的差異。

圖2 樣本序列與越桔屬psbA-trnH核苷酸序列多序列比對結(jié)果

2.2.2 越桔屬psbA-trnH堿基序列組成及長度

運(yùn)用MEGA5.1分析越桔屬psbA-trnH堿基序列組成，16份越桔屬植物的G+C值存在著一定差異，為32%～35%，序列長度為400～477 bp。保守位點(diǎn)C(%)為96.3%，變異位點(diǎn)V(%)為3.7%，說明越桔屬間變異較小(表1)。

表1 越桔屬psbA-trnH堿基序列組成及長度

2.2.3 篤斯越桔與GeneBank中越桔屬植物的遺傳距離分析

運(yùn)用MEGA5.1軟件內(nèi)的P-distance算法計(jì)算遺傳距離(表2)。

表2 基于psbA-trnH序列的越桔屬各樣本遺傳距離

由表2可知，16個(gè)越桔屬植物psbA-trnH序列遺傳距離0～0.013，平均遺傳距離為0.005，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，120個(gè)遺傳距離中大于平均遺傳距離0.005的有58個(gè)，且相互差異較小，實(shí)驗(yàn)材料LJ_1與DFH_3、DFH_1、紅豆越桔(GU361911)遺傳距離為0，與DFH_2遺傳距離為0.002，與LJ_2遺傳距離為0.004，與篤斯越桔(GU361909)遺傳距離為0.002。

2.3 篤斯越桔psbA-trnH基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA5.1軟內(nèi)的Phylogeny生成Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，對GeneBank中越桔屬psbA-trnH基因序列建立的Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹進(jìn)行分析。由圖3可知，psbA-trnH基因越桔屬的系統(tǒng)進(jìn)化樹具有多條分支，其中由篤斯越桔與紅豆越桔聚合為1支，蔓越桔、狹葉越桔、烏飯樹、歐洲越桔、草地越桔、鹿莓越桔各自聚合為1支，結(jié)果表明，篤斯越桔與紅豆越桔親緣關(guān)系較近。

圖3 基于psbA-trnH序列的越桔屬樣本NJ系統(tǒng)樹

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼鑒定是利用基因組中1段公認(rèn)相對較短的序列對物種進(jìn)行識別鑒定，可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒別的局限[13]，由于部分植物種屬內(nèi)形態(tài)變異復(fù)雜，性狀受環(huán)境影響大， 往往呈多樣性，易對屬、組和種類的劃分造成影響，DNA條形碼技術(shù)可快速、準(zhǔn)確鑒定出物種，逐漸在植物的分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用[14]。隨著DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，在植物界的研究范圍越來越廣，目前有一些應(yīng)用較多的基因序列，如ITS、matK、rbcL和psbA-trnH等，但仍未達(dá)到成熟階段[15]。該研究利用葉綠體間隔序列psbA-trnH的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出完整序列片段，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定。該研究以長白山東方紅林場，與蘭家汪清林場的篤斯越桔為試驗(yàn)材料，與GeneBank中的越桔屬植物進(jìn)行比較分析，通過MEGA5.1計(jì)算越桔屬的遺傳距離，以及建立Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示5個(gè)篤斯越桔試驗(yàn)樣本與11個(gè)GeneBank中的越桔屬植物的psbA-trnH序列長度范圍為400～477 bp，越桔屬的psbA-trnH序列共有13個(gè)變異位點(diǎn)，且草地越桔存在堿基序列TATTCATTTTG的插入、蔓越桔存在堿基序列TTGAAAATAA缺失。越桔屬遺傳距離的范圍為0.000～0.013，平均遺傳距離為0.005，篤斯越桔的種內(nèi)平均距離小于越桔屬的平均遺傳距離。對越桔屬Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹分析得出，16個(gè)越桔屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹具有兩組分支，其中1組分支由篤斯越桔與紅豆越桔、鹿莓越桔聚合為1支，再與蔓越桔與狹葉越桔、烏飯樹聚為合1支，另一組分支由歐洲越桔與草地越桔聚合為1支，篤斯越桔與紅豆越桔親緣關(guān)系較近。由于近些年篤斯越桔被不斷地研究開發(fā)，市場上出現(xiàn)了一些假冒產(chǎn)品來迷惑消費(fèi)者，其中黑加侖是外觀與篤斯越桔相近的一種小漿果，常有商販通過販賣黑加侖欺騙消費(fèi)者來獲取高額利潤，更有商家通過加工成商品讓消費(fèi)者無法通過外觀辨別真假，通過越桔屬的psbA-trnH基因序列與GeneBank中黑加侖psbA-trnH基因序列進(jìn)行對比分析，兩者序列存在明顯差異，所以依據(jù)psbA-trnH序列的差異不僅可以鑒定親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的越桔屬植物，也可以鑒別出假冒篤斯越桔的商品，同時(shí)為進(jìn)一步研究越桔屬植物的進(jìn)化與分布奠定基礎(chǔ)。