大腸桿菌計(jì)數(shù)方法的比較與相關(guān)性分析

李亭玉， 孔 潔， 王 元， 崔明勛， 李艷茹， 李太元

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli簡稱大腸桿菌)，是腸道內(nèi)共生菌[1],為單細(xì)胞生物呈單個(gè)或成對存在[2]，平板計(jì)數(shù)法和顯微計(jì)數(shù)法是目前較為常見的2種細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，但耗時(shí)長，操作復(fù)雜；顯微計(jì)數(shù)法所需時(shí)間短，操作簡單，但計(jì)數(shù)結(jié)果誤差較大[3]，大腸桿菌血清型眾多、毒力基因和耐藥基因復(fù)雜[4]，而大腸桿菌的計(jì)數(shù)常被用于制備生物制品和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，因此，細(xì)菌計(jì)數(shù)方法簡單便捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)顯得尤為重要[5]。

分光光度計(jì)，又稱光譜儀，是利用1個(gè)可以產(chǎn)生不同波長的光源，通過系統(tǒng)分裝裝置，從而產(chǎn)生指定波長的光源，指定波長的光源透過待測的樣本后，一部分光線被樣本吸收，并計(jì)算出樣本的吸光度，也稱為樣本的OD值，從而轉(zhuǎn)化成樣本的濃度。濁度計(jì)是利用樣本對光進(jìn)行透射或散射的原理制成的一種測定樣本濁度的儀器，當(dāng)光線投射到樣本上，散射光強(qiáng)、入射光強(qiáng)、透射光強(qiáng)的比值和樣本濁度存在著一定的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而來測定樣本的濁度。李林思等[6]研究表明，光合細(xì)菌的細(xì)菌濃度與其光密度的相關(guān)關(guān)系顯著，本試驗(yàn)通過分光光度法和濁度法探究大腸桿菌菌液的吸光度和濁度與活菌數(shù)量之間的關(guān)系。

本文對大腸桿菌的常用計(jì)數(shù)方法進(jìn)行比較研究，并探究吸光度和濁度與活菌數(shù)之間的關(guān)系，為大腸桿菌的計(jì)數(shù)問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌(Escherichiacoli編號：1.2385)購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 藥品與試劑

營養(yǎng)肉湯，瓊脂粉(均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)等。

1.1.3 儀器

分光光度計(jì)(U-1800型)；濁度計(jì)(WGZ-2000型)；生物顯微鏡(BX53型)等。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

試驗(yàn)菌種以平板劃線法接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h[7]后，用接種環(huán)挑取平板中3～5個(gè)菌落，接種于50 mL普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，備用，所使用的菌液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，避免存放時(shí)間過長導(dǎo)致細(xì)菌死亡，產(chǎn)生誤差。

1.2.2 大腸桿菌計(jì)數(shù)方法的比較

將大腸桿菌原液充分混勻，并等量分裝于試管中，用無菌生理鹽水分別稀釋成4、6、8、10倍，將4個(gè)樣本的菌液用無菌生理鹽水倍比稀釋成10-6、10-7、10-8[8]，稀釋后每個(gè)稀釋度的菌懸液取200 μL用無菌涂菌棒均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到每平皿菌落數(shù)為30～300 cfu的菌落，3個(gè)平板菌落數(shù)取平均值，對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并推算出4個(gè)樣本中每毫升的活菌數(shù)量。

將上述稀釋的4個(gè)樣本用無菌生理鹽水倍比稀釋成10-2[8]，將稀釋后的菌液置于細(xì)菌計(jì)數(shù)板中，使菌液充滿計(jì)數(shù)區(qū)，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)出計(jì)數(shù)板中4個(gè)區(qū)域的細(xì)菌數(shù)，根據(jù)公式推算出4個(gè)樣本菌液每毫升的細(xì)菌數(shù)量。其公式為:

菌數(shù)/cfu·mL-1=每小格平均菌數(shù)×稀釋倍數(shù)÷1/4 000

1.2.3 OD600值和濁度與大腸桿菌活菌數(shù)量的線性研究

將細(xì)菌計(jì)數(shù)所稀釋的4、6、8、10倍的4個(gè)樣本作為試驗(yàn)材料，將分光光度計(jì)調(diào)至ABS單位，用無菌生理鹽水調(diào)零，在波長為600 nm時(shí)檢測4個(gè)樣本的OD值；同上述相同的試驗(yàn)材料，用無菌生理鹽水調(diào)零，用濁度計(jì)檢測4個(gè)樣本的濁度(單位為AUT)。將檢測出的4個(gè)樣本OD600值和濁度與平板計(jì)數(shù)法所計(jì)的大腸桿菌活菌數(shù)用Microsoft Excel 2019統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行線性回歸分析[9]，探討大腸桿菌活菌數(shù)與其OD600值和濁度是否存在著一定的數(shù)量關(guān)系。

1.2.4 分光光度計(jì)及濁度計(jì)的靈敏度測定試驗(yàn)

將細(xì)菌原液用無菌生理鹽水分別稀釋4、6、8、10、12、40、60、80、100、120、1 200倍，用無菌生理鹽水調(diào)零，采用分光光度計(jì)在波長為600 nm時(shí)測定細(xì)菌原液及各稀釋樣的OD值[10]；同上述稀釋濃度，用無菌的生理鹽水調(diào)零，用濁度計(jì)測量細(xì)菌原液及各稀釋度樣本的濁度[11]。根據(jù)數(shù)據(jù)分析分光光度計(jì)及濁度計(jì)的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板計(jì)數(shù)與顯微計(jì)數(shù)方法的比較

平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，且所計(jì)的細(xì)菌均為活菌，但操作繁瑣，所需的時(shí)間較長；顯微計(jì)數(shù)法操作簡單，所需時(shí)間短，但準(zhǔn)確度較低。2種計(jì)數(shù)方法同時(shí)檢測，比較二者的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：在2種計(jì)數(shù)方法中，細(xì)菌數(shù)量隨細(xì)菌稀釋度的增加呈逐漸減少的趨勢，顯微計(jì)數(shù)法所計(jì)的細(xì)菌數(shù)量略比平板計(jì)數(shù)法的細(xì)菌數(shù)量多(圖1)。

圖1 2種計(jì)數(shù)方法的比較結(jié)果Fig.1 Comparison of two counting methods

2.2 OD600值與大腸桿菌活菌數(shù)的線性研究

取平板計(jì)數(shù)所得的活菌數(shù)和與其對應(yīng)的OD600為分析對象，用Microsoft Excel 2019統(tǒng)計(jì)軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析得出，在大腸桿菌菌液OD600值約為0.3～0.65時(shí)，OD600值與菌液中活菌數(shù)量有相關(guān)性(圖2)，其線性回歸方程為y=27.067 x-4.025，系數(shù)為0.998 2。

圖2 OD600值與活菌數(shù)量之間的線性關(guān)系

2.3 濁度與大腸桿菌活菌數(shù)的線性研究

取平板計(jì)數(shù)所得的活菌數(shù)和與其對應(yīng)的濁度為分析對象，用Microsoft Excel 2019統(tǒng)計(jì)軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得出在大腸桿菌菌液濁度約為30～90 NTU時(shí)，菌液的濁度與活菌數(shù)量有相關(guān)性(圖3)，其線性回歸方程為y=0.156 x-0.169，系數(shù)為0.998 7。

圖3 濁度與活菌數(shù)量之間的線性關(guān)系

2.4 分光光度計(jì)及濁度計(jì)的靈敏度測定

將原液分別稀釋成11個(gè)稀釋度，測定原液及各個(gè)稀釋度的OD600值和濁度。由表1可知，當(dāng)菌液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.008 3以下時(shí)，分光光度計(jì)已無法檢測其OD600值，而濁度儀仍能檢測，由此可見，濁度法較分光光度法更加靈敏。由圖4、5可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以上時(shí)，OD600值隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而升高，具有相關(guān)性；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以下時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)與OD600值之間發(fā)生偏離，由此可得出，當(dāng)OD600值約在0.034以下時(shí)，分光光度計(jì)會產(chǎn)生偏差。由圖6、7可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以上時(shí)，濁度隨菌液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而升高，具有相關(guān)性；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以下時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)與濁度之間有些偏離，由此可得出，當(dāng)濁度在3.34以下時(shí)，濁度法會產(chǎn)生略微偏差，但較分光光度法而言，偏差較小。

表1 OD600值及濁度與質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

注：“/”表示儀器無法檢測。

圖4 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以上時(shí)與OD600值的關(guān)系Fig.4 The relationship between OD600 and mass fraction above 0.025

圖5 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以下時(shí)與OD600值的關(guān)系

圖6 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以上時(shí)與濁度的關(guān)系Fig.6 The relationship between turbidity and massfraction above 0.025

圖7 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以下時(shí)與濁度的關(guān)系

3 討論與結(jié)論

在實(shí)際生產(chǎn)中，細(xì)菌計(jì)數(shù)是基礎(chǔ)且重要的工作，其精確性十分重要。目前，較準(zhǔn)確的傳統(tǒng)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法主要有平板計(jì)數(shù)法和顯微計(jì)數(shù)法[12]，有研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌液的吸光度與細(xì)菌數(shù)量之間有一定的線性關(guān)系[13]，因此，該研究對大腸桿菌這幾種計(jì)數(shù)方法進(jìn)行比較研究，探究吸光度、濁度與大腸桿菌活菌數(shù)量之間的關(guān)系[14]并研究分光光度法及濁度法的靈敏度。

在相同稀釋度下，通過平板計(jì)數(shù)法和顯微計(jì)數(shù)法對大腸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，2種計(jì)數(shù)方法檢測的細(xì)菌數(shù)量有所差異，計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：顯微技術(shù)法>平板計(jì)數(shù)法。平板計(jì)數(shù)法所計(jì)數(shù)的均為活菌，但是操作過程繁瑣，所需的時(shí)間較長；顯微計(jì)數(shù)法操作過程簡單，所用時(shí)間短，但在顯微鏡下不容易辨別死亡的細(xì)菌。因此，顯微計(jì)數(shù)法所計(jì)細(xì)菌的數(shù)量會偏高。

該試驗(yàn)通過對濁度與活菌數(shù)和吸光度與活菌數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：當(dāng)大腸桿菌菌液OD600值約在0.3～0.65時(shí)，OD600值與菌液中活菌數(shù)量有相關(guān)性，其線性回歸方程為y=27.067 x-4.025；當(dāng)大腸桿菌菌液濁度約在30～90 NTU時(shí)，菌液的濁度與活菌數(shù)量有相關(guān)性，其線性回歸方程為y=0.156 x-0.169，R2>0.99，均呈良好的相關(guān)性，測量菌液的吸光度和濁度也可以推算出菌液的活菌數(shù)量，是一種簡單高效的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。

在分光光度法及濁度法的靈敏性測定試驗(yàn)中[15]，當(dāng)菌液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.008 3以下時(shí)，分光光度計(jì)已無法檢測其OD600值，而濁度計(jì)仍能檢測，由此可見，濁度法較分光光度法更加靈敏。當(dāng)菌液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以上時(shí)，二者無顯著差異，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)均具有相關(guān)性，當(dāng)菌液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025以下時(shí)，OD600值發(fā)生較大的偏離，而濁度的偏離程度較小，從而證明濁度法比分光光度法更加精確靈敏。