高壓脈沖電場技術(shù)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

張 燕， 趙頌寧， 赫桂丹， 劉博群， 劉靜波

(吉林大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 長春 130062)

0 引 言

高壓脈沖電場技術(shù)(High Intensity Pulsed Electric Fields, PEF)是高電壓工程和脈沖功率技術(shù)的結(jié)合，是最具有工業(yè)化應(yīng)用前景的非熱加工技術(shù)之一[1]。由于其低能耗、處理快速、且能避免或極大地降低食品在處理過程中的感官品質(zhì)和物理特性的變化，很大程度地保持食品的原有品質(zhì)，在食品工程和生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-4]。

在我校功能性食品實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，開放性、設(shè)計(jì)性綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)是其特色，實(shí)驗(yàn)的選題為實(shí)際樣品中功能成分的提取、分析檢測及功能學(xué)評價(jià)等。如“植物功能因子的提取技術(shù)”就是以“漿果之王”藍(lán)莓為原料，因其中含有大量的酚類和花青素類物質(zhì)，能有效清除體內(nèi)自由基，具有很高的抗氧化活性[5-8]。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)對藍(lán)莓中花青素、多酚等功效成分的提取多采用熱回流法，加熱處理會造成花青素和多酚物質(zhì)的降解破壞，有效成分含量下降[9-12]。本文建立的高壓脈沖電場法提取藍(lán)莓中多酚類物質(zhì)，采用響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，增加了教學(xué)實(shí)驗(yàn)的開放性與設(shè)計(jì)性，有利于學(xué)生創(chuàng)新性思維的開發(fā)、教學(xué)質(zhì)量的提高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PEF裝置(頻率1～3 kHz；處理液流速0～100 mL/min；處理室直徑1 mm;脈寬為1 μs)；

電子天平，BT25S，瑞士梅特勒-托利多公司；

紫外分光光度計(jì)，UV2550，日本島津公司；

干燥箱，PH-070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

冷凍藍(lán)莓果，由吉林大學(xué)提供；氫化錦葵色素-3-B-葡糖苷，Sigma公司；無水乙醇、濃鹽酸、碳酸鈉、福林酚試劑，均購自北京化工廠。

1.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取藍(lán)莓，磨漿，加入乙醇，調(diào)節(jié)pH值，均質(zhì)，高壓脈沖電場作用，放置12 h，過濾，取上清液，測定吸光度值。以總酚得率為評價(jià)指標(biāo)，考察料液比、乙醇濃度、pH值、電場場強(qiáng)、脈沖數(shù)對總酚得率的影響，單因素設(shè)計(jì)與水平見表1。

表1 單因素設(shè)計(jì)與水平

1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.5軟件中的 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多酚類化合物含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，各因子編碼與取值水平見表2。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取20 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配制成濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，搖勻，再加入2.5 mL福林酚(FC)試劑，搖勻。0.5～8 min內(nèi)加入

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

7.5 mL碳酸鈉溶液(20%)，混勻定容至刻度。避光，室溫靜置1 h，在750 nm處測定吸光度值，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為y=1.97x+0.021 1，R2=0.999 9。

圖1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

(1) 料液比的影響。在pH 2，電場場強(qiáng)45 kV/cm，乙醇濃度60%，脈沖數(shù)6的條件下，料液比分別選擇10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、1∶60，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對總酚得率的影響

從圖2中可以看出，料液比在30∶1～50∶1之間時(shí)，總酚得率較高，其中在40∶1時(shí)得率達(dá)到31.10%。當(dāng)料液比大于50∶1時(shí)，總酚得率略微降低。

(2) 乙醇濃度的影響。在pH2，電場場強(qiáng)45 kV/cm，料液比30∶1，脈沖數(shù)6的條件下，乙醇濃度分別選擇0%、20%、40%、60%、80%、100%，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對總酚得率的影響

從圖3中可以看出，乙醇濃度在60%～80%之間時(shí)，總酚得率較高，其中在80%時(shí)得率達(dá)到33.46%。當(dāng)乙醇濃度較高或較低時(shí)，總酚得率降低。

(3) pH值的影響。在乙醇濃度60%，脈沖數(shù)6，料液比30∶1，電場場強(qiáng)45 kV/cm的條件下， pH分別選擇1～6，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH值對總酚得率的影響

從圖4中可以看出，pH值在2～4之間時(shí)，總酚得率較高，其中在pH3時(shí)得率達(dá)到31.00%。

(4) 電場場強(qiáng)的影響。在料液比30∶1，乙醇濃度60%，pH 2，脈沖數(shù)6的條件下，電場場強(qiáng)分別選擇15、30、45、60、70 kV/cm，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，考察電場場強(qiáng)對其的影響。結(jié)果如圖5所示。

圖5 電場場強(qiáng)對總酚得率的影響

從圖5中可以看出，電場場強(qiáng)在30～60 kV/cm之間時(shí)，總酚得率較高，其中在45 kV/cm時(shí)得率達(dá)到30.31%。當(dāng)電場場強(qiáng)達(dá)到60、70 kV/cm，總酚得率明顯降低。

(5) 脈沖數(shù)的影響。在料液比30∶1，乙醇濃度60%，pH=2，電場場強(qiáng)45 kV/cm的條件下，脈沖數(shù)分別選擇2、4、6、8、10，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結(jié)果如圖6所示。

圖6 脈沖數(shù)對總酚得率的影響

從圖6中可以看出，脈沖數(shù)在4～8之間時(shí)，總酚得率較高，其中在6時(shí)得率達(dá)到31.38%。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化多酚類化合物提取條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定pH值在2～4、料液比在30∶1～50∶1、乙醇濃度在60%～80%，電場場強(qiáng)在30～60 kV/cm，脈沖數(shù)在4～8時(shí)，總酚得率較高。為進(jìn)一步優(yōu)化藍(lán)莓總酚提取條件，以總酚得率為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5b軟件中Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可見，第36個(gè)處理組總酚的得率最高，即在料液比40∶1、乙醇濃度75%、pH 3、電場場強(qiáng)45 kV/cm、脈沖數(shù)6的處理?xiàng)l件下，總酚得率可達(dá)到36.88%。

(2) 回歸模型的建立及方差分析。對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，建立多項(xiàng)式回歸模型，得到各因子編碼值的回歸方程

總酚得率=34.55-2.76A-1.46B-3.29C-

2.82D+1.19E+4.93AB+2.05AC+

0.87AD+0.94AE+1.14BC+1.00BD-

0.16BE-1.01CD-1.30CE-1.36DE-

4.92A2-7.76B2-8.06C2-5.96D2-7.09E2

對總酚得率的二次回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見表4。表4結(jié)果顯示，該模型(P<0.000 1)，具有高度顯著性，表明模型成立。模型失擬項(xiàng)P=0.199 3>0.1，不顯著，說明模型預(yù)測值和真實(shí)情況間無顯著性差異，模型擬合度較好。在回歸模型中一次項(xiàng)A、B、C、D、E，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2均表現(xiàn)出顯著水平。通過F值的比較，得出該模型各因素對響應(yīng)值總酚得率影響的顯著性大小為pH值>料液比>電場場強(qiáng)>乙醇濃度>脈沖數(shù)。

(3) 總酚得率響應(yīng)面分析圖。各因素之間兩兩交互作用分析等值線和曲面如圖7所示。由圖7中曲面圖可以看出，各圖均呈開口向下，凸形的曲面，具有極值。等高線圖中由圖7(a)可以看出，料液比(A)和乙醇濃度(B)等高線圖呈橢圓形，說明兩者之間交互作用極顯著，隨著料液比和乙醇濃度不斷增大，多酚得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。其他幾個(gè)因素兩兩間交互作用等高線圖呈圓形，說明交互作用不顯著，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著兩者不斷增大，總酚得率呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)乙醇濃度固定不變時(shí)，總酚得率隨料液比、pH值、電場場強(qiáng)和脈沖數(shù)的增加而先增加后降低，可能是因?yàn)楦邏好}沖電場處理過的液體顆粒度降低，增大顆粒與溶劑的接觸面積，得率增大。但當(dāng)電場場強(qiáng)和脈沖數(shù)過大時(shí)，總酚得率迅速下降，可能因?yàn)槠茐牧丝偡拥慕Y(jié)構(gòu)從而影響了得率[14-15]。當(dāng)電場場強(qiáng)和脈沖數(shù)固定不變時(shí)，乙醇濃度增加，總酚得率先增加后降低。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 二次回歸方程方差分析

注：**表示該水平極其顯著(P<0.01)；*表示該水平顯著(P<0.05)

通過響應(yīng)面分析法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化后，可以得出藍(lán)莓多酚類化合物提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比34.99∶1、乙醇濃度70.60%、pH值2.72、電場場強(qiáng)

(a) 料液比和乙醇濃度對總酚得率的影響

(b) 料液比和pH值對總酚得率的影響

(c) 料液比和電場場強(qiáng)對總酚得率的影響

(d) 料液比和脈沖數(shù)對總酚得率的影響

(e) 乙醇濃度和pH值對總酚得率的影響

(f) 乙醇濃度和電場場強(qiáng)對總酚得率的影響

(g) 乙醇濃度和脈沖數(shù)對總酚得率的影響

(h) pH值和電場場強(qiáng)對總酚得率的影響

(i) pH值和脈沖數(shù)對總酚得率的影響

(j) 電場場強(qiáng)和脈沖數(shù)對總酚得率的影響

圖7 響應(yīng)面分析圖

40.70 kV/cm、脈沖數(shù)6.22，預(yù)測總酚的得率為36.381 6%。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際情況是否一致，進(jìn)一步做了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)驗(yàn)的方便性，將各因素?cái)?shù)值進(jìn)行取整后最佳工藝參數(shù)為：料液比35∶1、乙醇濃度70%、pH值2.7、電場場強(qiáng)40 kV/cm、脈沖數(shù)6，所得總酚得率為36.4%，與預(yù)測值的差異小于0.05%。因此，利用響應(yīng)面法對高壓脈沖電場提取藍(lán)莓中酚類化合物的條件是可行的，得到的多酚類化合物的提取方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為實(shí)驗(yàn)操作提供技術(shù)參考。

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)將學(xué)生在食品專業(yè)基礎(chǔ)課中學(xué)到的功能因子高效分離技術(shù)理論知識，結(jié)合現(xiàn)代高新提取技術(shù)，應(yīng)用到功能性食品教學(xué)實(shí)驗(yàn)中。即將高壓脈沖電場技術(shù)應(yīng)用于功能性食品植物有效成分提取實(shí)驗(yàn)中，在老師的指導(dǎo)下，學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，運(yùn)用單因素及響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，和傳統(tǒng)教學(xué)實(shí)驗(yàn)“冷浸法提取藍(lán)莓中酚類化合物”相比，本研究將現(xiàn)代大型儀器與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合，不僅提高了藍(lán)莓中多酚類化合物得率，采用不同的提取手段實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)意圖，還增加了教學(xué)實(shí)驗(yàn)的開放性和研究性，有利于豐富食品科學(xué)專業(yè)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)手段，有利于現(xiàn)代分離提取儀器在食品科學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用，有利于提高學(xué)生運(yùn)用新技術(shù)分析、解決復(fù)雜工程問題的能力[16-17]。因此，這一成果的應(yīng)用對于實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的豐富及教學(xué)質(zhì)量的提高都有積極的影響。