蘭坪烏骨綿羊屠宰、烏質(zhì)性狀及基因克隆的研究進(jìn)展

劉興能，彭超超，苑夢(mèng)雅，席冬梅，姜祥夢(mèng)，王利平，鄧衛(wèi)東*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；3.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

蘭坪烏骨綿羊于2001 年由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛華明教授首次發(fā)現(xiàn)，蘭坪烏骨綿羊的烏骨烏肉性狀并非鉛鋅（Pb、Zn）中毒，而是由高含量的黑色素沉積（與烏骨雞一樣）所致，且烏質(zhì)性狀可遺傳，經(jīng)檢索后確認(rèn)蘭坪烏骨綿羊是世界唯一一種具有烏骨烏肉特征的哺乳類(lèi)動(dòng)物[1]，2006 年被正式命名為“蘭坪烏骨綿羊”，其體內(nèi)的黑色素可能具有藥用和保健價(jià)值，被譽(yù)為畜牧業(yè)的“國(guó)寶”[2]。2009 年通過(guò)農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源委員會(huì)認(rèn)定，蘭坪烏骨綿羊列入《中國(guó)珍稀動(dòng)物名錄》和《世界珍稀動(dòng)物名錄》，2011 年收錄于《中國(guó)畜禽遺傳資源志· 羊志》。本文系統(tǒng)總結(jié)了蘭坪烏骨綿羊的研究概況，并分析了影響蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的因素，為烏骨綿羊的研究與種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 蘭坪烏骨綿羊的外貌特征、屠宰性狀及肉品質(zhì)

1.1 蘭坪烏骨綿羊的外貌特征 蘭坪烏骨綿羊毛色有純白、純黑、雜色3 種，頭和四肢上的被毛短細(xì)，其他部位的被毛粗密，一般一年可剪2 次毛；多數(shù)無(wú)角（約占90%），角呈半螺旋狀向后，耳朵多數(shù)大而下垂，眼結(jié)膜呈淺墨色，牙齒、牙齦呈青綠透明；頸部短而無(wú)皺褶，鬐甲小低，背平直，胸寬深，腹大且不下垂，四肢粗短有力，前肢關(guān)節(jié)呈青紫色，肛門(mén)處呈烏黑色，尾端呈錐形。成年烏骨綿羊平均體重36～58 kg，體高61～68 cm，胸圍82～92 cm，尾長(zhǎng)18～19 cm。其體格大小、毛色等外貌與蘭坪本地綿羊相似，故粗看難以分辨蘭坪烏骨綿羊與蘭坪本地綿羊，但生產(chǎn)中可以通過(guò)仔細(xì)觀察犬齒、牙齦、眼結(jié)膜、關(guān)節(jié)、腋窩、肛門(mén)處6 個(gè)部位的顏色進(jìn)行感官區(qū)分[1]。

1.2 蘭坪烏骨綿羊的屠宰性狀及肉品質(zhì) 目前蘭坪烏骨綿羊屠宰性能及肉品質(zhì)試驗(yàn)報(bào)道十分有限，且試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道并不一致（表1、2）。在蘭坪烏骨綿羊的屠宰性能方面，陳圓等[3]試驗(yàn)表明，蘭坪烏骨綿羊與蘭坪本地普通綿羊相比，宰前活重、頭、骨、凈肉重、皮、胴體重蘭坪烏骨綿羊均較重（差異顯著），這一結(jié)果與范江平等[4]研究結(jié)果相悖。在蘭坪烏骨綿羊肉品質(zhì)方面，陳圓等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蘭坪烏骨綿羊背最長(zhǎng)肌的粗蛋白質(zhì)含量較蘭坪普通綿羊背最長(zhǎng)肌顯著高2.56%、粗脂肪低5.78%；而范江平等[4]試驗(yàn)表明，蘭坪烏骨綿羊背最長(zhǎng)肌的粗灰分中磷含量比蘭坪普通綿羊高0.13%。此外，常星耀等[5]隨機(jī)選用3 只1 歲、3 只1.5 歲蘭坪烏骨綿羊的背最長(zhǎng)肌、股二頭肌進(jìn)行羊肉營(yíng)養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明蘭坪烏骨綿羊羊肉粗蛋白質(zhì)含量比河南小尾寒羊高1.2%、粗脂肪含量比河南小尾寒羊低0.14%；蘭坪烏骨綿羊氨基酸總含量（18.71%）比河南小尾寒羊高0.29%，其中蘭坪烏骨綿羊含人體必需氨基酸中的色氨酸（Ser）、賴(lài)氨酸（Lys）含量分別為0.80、1.66 mg/100g；其他的營(yíng)養(yǎng)成分（脂肪酸、不飽和脂肪酸、多種礦物質(zhì)元素）含量豐富。

蘭坪烏骨綿羊與蘭坪本地普通綿羊屠宰性能及常規(guī)成分存在差異，其一是由于蘭坪烏骨綿羊剛發(fā)現(xiàn)時(shí)數(shù)量較少（201 只），沒(méi)有足夠的樣本容量；其二是由于發(fā)現(xiàn)其價(jià)值后價(jià)格昂貴，試驗(yàn)樣本不能滿足試驗(yàn)需要。

2 蘭坪烏骨綿羊的血液生理生化指標(biāo)

目前，國(guó)內(nèi)期刊關(guān)于蘭坪烏骨綿羊血液生理生化指標(biāo)的研究文獻(xiàn)僅有1 篇，即鄧衛(wèi)東等[6]對(duì)40 只蘭坪烏骨綿羊、23 只蘭坪本地普通綿羊、21 只羅姆尼羊進(jìn)行血液生化指標(biāo)的研究，結(jié)果顯示，蘭坪烏骨綿羊血液中超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力、血漿比色的相關(guān)系數(shù)均高于非烏骨綿羊；與非烏骨綿羊相比，蘭坪烏骨綿羊肝代謝功能旺盛，且有較強(qiáng)的自身免疫功能。可知，與非烏骨綿羊相比，烏骨綿羊具有較強(qiáng)的免疫力，肝代謝旺盛，解毒能力強(qiáng)。

3 蘭坪烏骨綿羊的烏質(zhì)性狀

3.1 黑色素概況 Berzelius 于1840 年首次使用黑色素（Melanin）這一名稱(chēng)，黑色素通常被定義為一類(lèi)由酚類(lèi)或吲哚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)氧化反應(yīng)形成的生物色素，因由許多不同類(lèi)型的單體以C-C 鍵結(jié)合而成，使得黑色素分子具有不溶于水與有機(jī)溶劑、抗?jié)馑岬忍匦訹7]。黑色素是在黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑小體上形成的。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的黑色素主要分為含硫的脫黑色素（Phaeomelanin）和不含硫的真黑色素（Eumelanin），前者呈黃色或微紅棕色，后者呈黑色或棕色。酪氨酸是形成黑色素的主要原料，酪氨酸酶系是酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏氐闹饕匏倜?。酪氨酸在酪氨酸酶的作用下?jīng)過(guò)一系列氧化反應(yīng)產(chǎn)生黑色素，即酪氨酸—多巴—多巴醌—多巴色素—二羥基吲哚—酮式吲哚—黑色素。

目前，雖然黑色素的結(jié)構(gòu)尚未完全研究清楚，但基本結(jié)構(gòu)是一些共價(jià)交聯(lián)的吲哚環(huán)。黑色素主要有以下4個(gè)重要的生物學(xué)功能[8]：①黑色素在蛋白質(zhì)交聯(lián)會(huì)的過(guò)程中提供機(jī)械力保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解；②黑色素的形成過(guò)程中正醌的產(chǎn)生對(duì)進(jìn)化有重要意義，能使一些親核基團(tuán)（-SH、-NH2）獲得抗生素特性；③黑色素是一種光保護(hù)色素；④黑色素與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，還能抗誘病[9-10]。

3.2 蘭坪烏骨綿羊的烏質(zhì)性狀

3.2.1 蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀定性與定量研究 蘭坪烏骨綿羊的烏質(zhì)性狀經(jīng)本課題組多年的研究可以確定為高含量的黑色素沉積所致。楊舒黎等[11]對(duì)蘭坪烏骨綿羊黑色素進(jìn)行紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，與烏骨雞真黑色素的吸收峰、分子結(jié)構(gòu)及IR 光譜總體特征相似[12-14]，說(shuō)明蘭坪烏骨綿羊的黑色素也為真黑色素。

蘭坪烏骨綿羊不同器官及不同年齡階段的黑色素含量不同。楊舒黎等[1]研究結(jié)果顯示，蘭坪烏骨綿羊的黑色素存在著時(shí)（年齡）空（組織器官）性差異，即隨著年齡（2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 歲）增加組織器官中的黑色素含量也增加，各組織器官中肝臟的黑色素含量最高，骨骼最低。這結(jié)果楊舒黎等[11]、與Muroya 等[15]研究結(jié)果一致。此外，根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果[1,6]推測(cè)，蘭坪烏骨綿羊較當(dāng)?shù)仄胀ňd羊的肝代謝旺盛、解毒能力強(qiáng)，可能與黑色素在肝臟上含量最高有關(guān)，黑色素可能具有解毒的醫(yī)用價(jià)值，這一推測(cè)還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

表1 烏骨綿羊與蘭坪本地綿羊屠宰性能的比較

表2 烏骨綿羊與蘭坪本地綿羊羊肉常規(guī)成分的比較 %

3.2.2 蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀相關(guān)生理生化特性 王鑫玉[16]對(duì)年齡基本相同的105 只烏骨綿羊、108 只蘭坪本地綿羊和83 只羅姆尼羊開(kāi)展了烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的生理生化特性研究，結(jié)果顯示，與蘭坪普通綿羊和羅姆尼羊相比，蘭坪烏骨綿羊的血漿比色（0.09、0.06、0.06 OD/mL）、酪氨酸酶活性（359.32、198.54L、123.66 IU/mL）、真黑色素、總黑色素含量（0.97、0.49、0.47 OD/mL）、真黑色素/總黑色素比例（0.27、0.19、0.10）均有顯著差異，但蘭坪烏骨綿羊和蘭坪普通綿羊血漿中脫黑色素含量（0.21、0.21 OD/mL）沒(méi)有顯著差異。由此可以得出：①高活力的酪氨酸酶是蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀形成的限速酶，是烏質(zhì)性狀形成的主要影響因素；②蘭坪烏骨綿羊的黑色素主要是真黑色素，這與楊舒黎等[11]研究結(jié)果基本一致，再次表明蘭坪烏骨綿羊的烏質(zhì)性狀是由真黑色素含量沉積所致。

3.3 蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀基因 目前烏骨綿羊具有烏骨烏肉性狀的黑色素基因是研究烏骨綿羊的一個(gè)重要方向，本課題組已經(jīng)進(jìn)行了多個(gè)影響黑色素合成代謝的基因研究。

楊舒黎[17]選用了40 只蘭坪烏骨綿羊、23 只蘭坪本地綿羊、21 只尋甸羅姆尼羊進(jìn)行烏質(zhì)性狀與TYR基因多態(tài)性相關(guān)分析，結(jié)果表明TYR的突變與烏質(zhì)性狀有關(guān)基因緊密相連，與鄧衛(wèi)東等[3]的研究結(jié)果一致，即烏骨綿羊TYR含量決定黑色素在肌肉上的沉積，從而形成烏骨綿羊的烏質(zhì)性狀。另外，還與眾多對(duì)TYR家族進(jìn)一步研究的結(jié)果一致（表3），即TYR基因家族不是烏骨綿羊控制烏質(zhì)性狀的主效應(yīng)基因。

舒文等[19]研究顯示，與蘭坪普通綿羊相比，蘭坪烏骨綿羊黑皮質(zhì)素受體1（MC1R）等位基因的頻率差異不顯著；與羅姆尼羊相比，蘭坪烏骨綿羊MC1R等位基因的頻率差異顯著，推測(cè)MC1R不是控制烏質(zhì)性狀的主效應(yīng)基因，這一結(jié)果與Deng 等[20]研究結(jié)論一致。

總結(jié)現(xiàn)有11 篇研究影響黑色素合成代謝主要因素的報(bào)道可以得出以下結(jié)論：①烏骨綿羊中TYR基因是影響黑色素沉積的主要原因，TYR酶活性對(duì)黑色素有限制作用；②RAB基因家族的表達(dá)豐度可能與烏質(zhì)性狀存在關(guān)聯(lián)；③CREB、GST可能是烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的候選基因，但需要進(jìn)一步的科學(xué)驗(yàn)證；④就目前的報(bào)道來(lái)看，SLC基因家族與黑色素的形成沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)。

目前，控制烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的主效應(yīng)基因尚未確定，大量研究證實(shí)控制黑色素的因素包括神經(jīng)、激素或兩者綜合影響，但對(duì)黑色素集中擴(kuò)散的機(jī)制尚不完全清楚，仍然處在探索與推測(cè)階段，這就說(shuō)明對(duì)蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀致因基因的研究仍任重而道遠(yuǎn)。

表3 蘭坪烏骨綿羊黑色素合成代謝主要影響因素的探索研究進(jìn)展

4 蘭坪烏骨綿羊基因克隆

Deng 等[29]最早對(duì)蘭坪烏骨綿羊的TYR、MC1R和Agouti 信號(hào)蛋白基因（ASIP）進(jìn)行克隆測(cè)定后與普通綿羊相應(yīng)基因的序列對(duì)比進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明蘭坪烏骨綿羊的TYR外顯子1 與蘭坪普通綿羊相比有2 個(gè)同義突變，分別為DQ530058 和DQ530059（突變點(diǎn)192G>C 和462C>T）；蘭坪烏骨綿羊較蘭坪普通綿羊的MC1R 中同源突變是DQ530056 和DQ530057（突變點(diǎn)12A>G 和144G>C）；蘭坪烏骨綿羊血液的ASIP 序列（DQ531713）和普通綿羊血液的ASIP 序列（DQ531714）無(wú)顯著差異。

趙素梅等[30]從烏骨綿羊的肌肉組織全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）獲得了與任何綿羊及山羊的基因核苷酸序列不同的3 個(gè)全新基因，即ATP 合成酶亞基O（ATP50）、NADH 脫氫酶1α亞基（NDUFA12）、泛醇-細(xì)胞色素C 還原酶鉸鏈蛋白（UQCRH），結(jié)果表明烏骨綿羊的以上3 個(gè)基因和蛋白質(zhì)序列與牛的遺傳關(guān)系較近；ATP50、UQCRH 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以被模擬；不同組織表達(dá)量不同。

Li 等[31]通過(guò)收集6 只成年烏骨綿羊的腿部肌肉、腎臟、皮膚、背最長(zhǎng)肌、脾臟、心臟和肝臟等組織分離磷酸酯酶基因（PSPH）、重組人U2 小核核糖核蛋白肽A（SNRPA1）和重組人原肌球蛋白-1（TPM1）基因，然后將烏骨綿羊PSPH、SNRPA1和TPM1基因的PCR 產(chǎn)物克隆到PMD18-T 載體中并雙向測(cè)序，分析表明烏骨綿羊PSPH、SNRPA1和TPM1基因與非烏骨綿羊基因不同源；烏骨綿羊PSPH、SNRPA1和TPM1與牛PSPH、SNRPA1和TPM1具有密切的親緣關(guān)系；3種基因在不同組織中表達(dá)程度不一。該文獻(xiàn)是烏骨綿羊的PSPH、SNRPA1和TPM1基因克隆進(jìn)行必要的功能分析和組織表達(dá)譜的第1 篇報(bào)告。

李隱俠等[32]采取了云南烏骨綿羊耳組織樣（取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所羊場(chǎng)），利用相關(guān)PCR等技術(shù)獲得烏骨綿羊成纖維細(xì)胞核受體Nr5a2 抗體（NR5A2）基因的外顯子序列并對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果表明烏骨綿羊蛋白編碼氨基酸序列同源性與牛和湖羊較高，分別為89.66%、99.41%，烏骨綿羊的NR5A2 蛋白不穩(wěn)定，不存在信號(hào)肽，不是分泌蛋白，未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)，是非跨膜蛋白；烏骨綿羊NR5A2基因編碼區(qū)核苷酸序列與牛同源性有85.51%，與湖羊同源性較高為99.87%，有C1069A、C1419T 和G1485A 3 個(gè)突變位點(diǎn)，且C1069A 能引起相應(yīng)氨基酸的改變。

Hesham 等[33]對(duì)蘭坪烏骨綿羊、蘭坪普通綿羊耳樣品內(nèi)皮素3（EDN3）基因分子進(jìn)行克隆和鑒定，結(jié)果顯示EDN3不是色素沉著過(guò)度的原因，但可能在蘭坪烏骨綿羊的免疫和排泄系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。

綜上可知，蘭坪烏骨綿羊基因的親緣關(guān)系與牛較近，克隆了烏骨綿羊5 個(gè)基因并發(fā)現(xiàn)了一些多態(tài)位點(diǎn)，這對(duì)烏骨綿羊的遺傳與育種具有初步指導(dǎo)作用。

5 蘭坪烏骨綿羊的保護(hù)開(kāi)發(fā)與展望

自蘭坪烏骨綿羊被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其集科研、食用、藥用于一身，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，受到眾多專(zhuān)家學(xué)者及市場(chǎng)青睞，對(duì)蘭坪烏骨綿羊的保護(hù)和開(kāi)發(fā)亟需完善保種方案。由此提出以下建議：①在開(kāi)發(fā)的同時(shí)注意保種，由區(qū)域化推向全國(guó)化，杜絕雜亂散養(yǎng)，建立保護(hù)區(qū)與核心區(qū)；②注重選育原則與方法，配種以本交為主，人工授精為輔；③加強(qiáng)保護(hù)制度、研究力度；④進(jìn)一步針對(duì)烏質(zhì)性狀影響因素及形成機(jī)制開(kāi)展更深入研究，尋找出控制烏質(zhì)性狀的致因基因，為蘭坪烏骨綿羊的保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。