向光明，劉秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，馬 琳，曾憲垠，曹曉涵*，儲明星*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川雅安 625014）

綿羊發(fā)情主要分為常年發(fā)情與季節(jié)性發(fā)情兩大類型，常年發(fā)情是指動物一年四季均可發(fā)情，不受長、短日照季節(jié)的影響，季節(jié)性發(fā)情是指動物發(fā)情受長、短日照季節(jié)的影響較大，一般在秋季發(fā)情，而其他季節(jié)都不發(fā)情。我國綿羊大部分屬于季節(jié)性發(fā)情，這限制了我國肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的基因，如褪黑激素受體1A（MTNR1A）[2]、二型脫碘酶（DIO2）[3]、親吻素-1（KiSS1）、G 蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）[4]、芳基烷基胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AA-NAT）[5]、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF)[6]等。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)鐘基因可能與季節(jié)性發(fā)情調(diào)控有關(guān)，例如在牛的卵巢顆粒細胞中，鐘基因的表達能影響促黃體素受體（LHR）和孕酮的產(chǎn)生，從而影響雌性動物的發(fā)情[7]；在哺乳動物垂體中存在年節(jié)律鐘，控制著下丘腦和垂體形態(tài)的周期性轉(zhuǎn)變以及EYA3和CHGA基因的表達，從而影響哺乳動物的季節(jié)性繁殖[8]；還有研究直接表明鐘基因的突變會打斷發(fā)情周期，降低繁殖力等[9]。近來還有研究進一步發(fā)現(xiàn)鐘基因PER2的表達受繁殖激素影響，如Karman 等[10]在大鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)促黃體激素（LH）能調(diào)控鐘基因PER2的表達；Hickok 等[11]證明了下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）神經(jīng)元中存在生物鐘，且GnRH 對PER2基因的周期性表達有影響；Nakamura 等[12]研究發(fā)現(xiàn)雌激素也能影響PER1、PER2的周期性表達。哺乳動物成功繁殖是由一系列依靠激素的行為及生理活動組成，這些過程又受生物鐘調(diào)控[13]，PER2是生物鐘震蕩的核心分子[14]，它很可能與繁殖調(diào)控有關(guān)，但它究竟是怎樣影響綿羊繁殖目前還不清楚。

本研究主要檢測了不同發(fā)情性狀的2 種綿羊繁殖相關(guān)組織中PER2基因表達特征，并對不同綿羊群體重測序篩選出來的PER2基因g.2852655T>C 位點的多態(tài)性進行分析，探究PER2基因與綿羊季節(jié)性繁殖的關(guān)系，同時確認該位點對小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)是否產(chǎn)生影響，以期找到分子標記位點，為綿羊育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 蘇尼特羊和小尾寒羊均來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗基地。選取健康的非發(fā)情狀態(tài)的蘇尼特羊母羊（長光照）和小尾寒羊母羊（黃體期）各3 只，在同期發(fā)情后第7 天對挑選的綿羊進行屠宰，然后分別采集10 種組織（下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、子宮體、輸卵管、腎和腎上腺），迅速裝入2 mL的RNase-free 凍存管中，進行冷凍保存?zhèn)溆?。大群分型血液DNA 樣品選擇：共768 只羊，季節(jié)性發(fā)情綿羊包括蘇尼特羊21 只、草原型藏羊161 只和灘羊22 只；常年發(fā)情綿羊包括湖羊101 只、策勒黑羊52 只和小尾寒羊411 只(其中380 只有產(chǎn)羔數(shù)記錄)。每個DNA 樣品需要量為20 μL，濃度為40～80 ng/μL。

1.2 引物設(shè)計 參照GenBank 提供的綿羊PER2基因mRNA 序列（XM_015091817），利用Primer3 軟件進行跨外顯子引物設(shè)計，以β-actin基因（NM_001009784）作內(nèi)參。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，引物具體信息見表1。

表1 綿羊PER2 基因的引物信息

1.3 RNA 提取和cDNA 第1 鏈合成 動物組織總RNA提取方法參照本實驗室前期RNA 的提取和cDNA 第1 鏈合成方法[6]。20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5X Prime Script Buffer（for Real Time）4.0 μL，RNA 1.0 μL，RNase-free ddH2O 12.0 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：37℃ 15 min；85℃ 5 s。20 μL 半定量PCR（sqRT-PCR）反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。sqRT-PCR 反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性 30 s；61℃退火30 s ；72℃延伸30 s；28 個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。20 μL qPCR 體系：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。qPCR 反應(yīng)程序：94℃預變性5 s；94℃變性5 s，61℃ 30 s，40 個循環(huán)。

1.4 sqRT-PCR 和qPCR 反 應(yīng) 將合成的cDNA 第1 鏈合成進行5 倍稀釋，先進行sqRT-PCR 檢測引物特異性將符合標準的cDNA 用于qPCR 反應(yīng)，檢測目的基因PER2的表達。sqRT-PCR 和qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見1.3，qPCR 反應(yīng)具體步驟參照本實驗前期方法[15]。

1.5 基因分型 本實驗室前期對10 個綿羊品種的99個個體進行全基因組測序[16]，篩選獲得PER2基因的g.2852655T>C 位點，然后采用Sequennom Mass ARRAY?SNP 技術(shù)對PER2的該位點在不同發(fā)情性狀的綿羊品種中進行分型。

1.6 統(tǒng)計分析 熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量[15,17]，用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件中的一般線性模型中單因素方差分析的最小顯著差異（LSD）法對不同繁殖性狀之間相對表達量以及不同基因型在季節(jié)發(fā)情和常年發(fā)情之間的差異進行分析，同時將PER2基因的g.2852655T>C 位點的多態(tài)性與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)做關(guān)聯(lián)分析。用Excel2016 計算PER2基因的g.2852655T>C位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）及有效等位基因數(shù)（Ne），并進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 總的RNA 提取和cDNA 合成 用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA 的完整性進行檢測，如圖1 所示，RNA完整性良好。同時以β-actin為內(nèi)參，PER2為目的基因作標準曲線，得到單一且銳利的熔解曲線（圖略），且擴增效率分別為100%和97.7%，說明引物特異性好，可以進行后續(xù)的熒光定量實驗。

2.2PER2基因在不同發(fā)情性狀綿羊之間的sqRT-PCR 檢測 如圖2 所示，在蘇尼特羊中，PER2基因在小腦中表達量最高，垂體、卵巢和子宮中表達量次之；在小尾寒羊中，PER2基因在各個組織中的表達量均較低，在松果體、下丘腦和垂體中較高。

圖1 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 PER2 和β-actin 在蘇尼特羊和小尾寒羊10 種組織中的sqRT-PCR

2.3PER2基因在不同發(fā)情性狀綿羊之間組織表達分析如圖3 所示，PER2基因在蘇尼特羊和小尾寒羊各繁殖相關(guān)組織中均有表達。品種間比較發(fā)現(xiàn)，PER2基因在蘇尼特羊和小尾寒羊松果體、下丘腦的表達量并無顯著差異，垂體中小尾寒羊PER2的表達量略高于蘇尼特羊，也沒有顯著差異，在輸卵管中小尾寒羊極顯著高于蘇尼特羊，但在卵巢中蘇尼特羊顯著高于小尾寒羊，子宮中的表達量差異達到極顯著水平。

圖3 PER2 基因在蘇尼特羊和小尾寒羊各組織中的表達

2.4PER2基因的多態(tài)性分析 對本實驗室前期通過10個綿羊品種的99 個個體進行全基因組重測序篩選的PER2基因的g.2852655T>C 位點進行分型發(fā)現(xiàn)，該位點在6 個綿羊品種中存在3 種基因型，分別為TT、TC和CC。

由表2 可以看出，PER2基因g.2852655T>C 位點在季節(jié)發(fā)情和常年發(fā)情綿羊中基因型頻率和等位基因頻率都具有極顯著差異。該位點在2 個不同發(fā)情性狀的綿羊品種中突變的等位基因C 均為優(yōu)勢等位基因，在季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中TC 為優(yōu)勢基因型，在常年發(fā)情品種中CC 為優(yōu)勢基因型。

從表3 可知，PER2基因g.2852655T>C 位點在6個綿羊品種中均處于中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5）；卡方檢驗表明，除了小尾寒羊外，該位點在其他5 個綿羊品種均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P≥0.05）。

2.5PER2基因g.2852655T>C 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系 為探究PER2位點突變是否會影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)，將PER2基因g.2852655T>C 位點分別與有產(chǎn)羔記錄的380 只小尾寒羊的第1、2、3 胎產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析。如表4 所示，g.2852655T>C 與小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)并無顯著關(guān)聯(lián)。

3 討 論

3.1PER2基因的表達分析 本研究通過sqRT-PCR 發(fā)現(xiàn)，PER2基因在2 種綿羊中各組織都有表達，這與PER2基因在生物體的各個組織中均有表達相一致[16,18]。此外，還發(fā)現(xiàn)PER2基因在蘇尼特羊卵巢和子宮中的表達高于小尾寒羊，暗示PER2基因的表達可能與季節(jié)發(fā)情調(diào)控有關(guān)。

qPCR 結(jié)果表明，在松果體、下丘腦和垂體中2 種綿羊PER2的表達量均較低。一方面可能與本實驗采樣在07:00 左右有關(guān)，很多研究表明PER2在該時間的表達都很低[19-20]。另外可能是2 種羊都處于非發(fā)情期，光照刺激通過增強雌激素的負反饋作用而抑制促性腺軸的活性，導致GnRH/LH 周期性釋放活動停止[21]，LH 表達降低，使PER2的表達降低。也有研究表明在下丘腦和卵巢中發(fā)現(xiàn)LH 處理能提高PER2的表達水平[15,22]，導致PER2基因的表達在2 種綿羊的松果體、下丘腦和垂體組織中并沒有顯著差異。

在卵巢中，蘇尼特羊PER2基因的表達量顯著高于小尾寒羊。有研究發(fā)現(xiàn)，在牛的顆粒細胞中較高水平的PER2表達會抑制促黃體激素受體（LHR）的表達及孕酮的產(chǎn)生[7]，所以蘇尼特羊PER2基因的高表達會使卵泡的發(fā)育和成熟受到抑制，從而處于非發(fā)情狀態(tài)，這也證實了sqRT-PCR 的結(jié)果。小尾寒羊從卵泡期轉(zhuǎn)換到黃體期需要孕酮的作用，需要解除PER2基因?qū)υ型漠a(chǎn)生的抑制作用，PER2的表達量自然很低。在輸卵管中，小尾寒羊PER2的表達高于蘇尼特羊，可能是常年發(fā)情的小尾寒羊進入黃體期后，輸卵管在卵子運輸及為受精準備的過程中發(fā)揮重要作用[23]。Kennaway 等[23]發(fā)現(xiàn)的大鼠輸卵管中PER2基因呈節(jié)律性表達也暗示了這一點。在子宮中，蘇尼特羊PER2的表達顯著高于小尾寒羊，可能與該時期子宮狀態(tài)有關(guān)。子宮對著床的敏感度分為預受期、接受期及不應(yīng)期3 個時期，而子宮只有在接受期才能接受和適應(yīng)胚胎[24]。本實驗的小尾寒羊剛進入黃體期，子宮可能處于不應(yīng)期，PER2的表達較低。另外還有研究表明PER2使子宮內(nèi)膜增殖與非周期性蛻膜基因表達的啟動同步，可以為胎兒發(fā)育提供良好的環(huán)境，而沉默PER2的表達可能會導致流產(chǎn)[25]，說明PER2的表達對胎兒發(fā)育也起著重要作用。在子宮中蘇尼特羊PER2基因表達較高還有可能與子宮樣品采集的位置有關(guān)。有研究表明，子宮中所有鐘基因的表達具有高度區(qū)域特異性，而晝夜變化則相對較小[26]。

表2 PER2 基因g.2852655T>C 位點在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中基因型頻率和等位基因頻率

表3 PER2 基因g.2852655T>C 位點在6 個綿羊品種中的群體遺傳學分析

表4 PER2 基因g.2852655T>C 位點不同基因型的小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)（最小二乘均值±標準誤）

3.2PER2基因多態(tài)位點與綿羊繁殖性狀之間的相關(guān)性 通過大群分型和群體遺傳學分析可知，PER2基因g.2852655T>C 位點在6 個綿羊品種中存在3 種基因型，且該位點在2 種發(fā)情性狀綿羊品種中基因型頻率和等位基因頻率具有顯著差異，說明該位點是一個綿羊季節(jié)性調(diào)控的候選位點。該位點在6 個綿羊品種中均處于中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5），說明該位點具有較強的選擇潛力。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，該位點與小尾寒羊第1、2、3 胎產(chǎn)羔數(shù)雖無顯著關(guān)聯(lián)，但相對來說，在小尾寒羊中第1、2 胎雜合突變的TC 基因型的平均產(chǎn)羔數(shù)較多，純合突變次之，野生型較少，說明該位點突變在一定程度上提高了產(chǎn)羔數(shù)，對小尾寒羊群體來是一種有益突變。而Pilorz 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鐘基因PER2突變的中年雌性小鼠，發(fā)情周期會發(fā)生紊亂，可能是加速了小鼠的老齡化，最終導致雌性繁殖力下降。這與本實驗結(jié)果不一致，可能是本實驗PER2基因只是單堿基位點突變，并沒有影響PER2基因的正常功能，反而在一定程度上提高了產(chǎn)羔數(shù)。用鐘基因突變模型來研究生物鐘穩(wěn)定對哺乳動物繁殖影響時所說的突變是整個或部分基因的敲除[28]，導致鐘基因不表達或者功能喪失，最后嚴重影響了哺乳動物繁殖的性能。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊PER2基因在卵巢中的表達量顯著高于常年發(fā)情小尾寒羊，推測PER2基因在卵巢中較高水平表達抑制LHR 表達及孕酮分泌，進而調(diào)控綿羊的季節(jié)發(fā)情，且PER2可能與卵子受精、胚胎發(fā)育調(diào)控相關(guān)；另外，PER2基因g.2852655T>C 可能是綿羊季節(jié)性發(fā)情調(diào)控的關(guān)鍵位點，對分子育種具有重要參考意義。