結直腸癌患者血清中骨膜蛋白與癌胚抗原的變化分析

張業(yè)霞，張佳倫，邵文錦，趙 晶，李淑敏

(菏澤醫(yī)學?？茖W校：1.免疫與微生物學教研室；2.學報編輯部；3.預防醫(yī)學教研室，山東菏澤 274000;4.菏澤市立醫(yī)院檢驗科，山東菏澤 274000)

大腸癌又稱結直腸癌，是源自腸黏膜上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病率在全球逐漸增加，已上升到癌癥發(fā)病率的第3位。由于其高發(fā)病率、惡性行為、缺乏治療策略的重大進展，且不同的臨床病理特征可能會影響結直腸癌的預后，早期預防和早期診斷對控制結直腸癌的發(fā)病及預后非常關鍵。常見的血清學腫瘤標志物如癌胚抗原CEA)、糖鏈抗原19-9(CA19-9)等已廣泛應用于結直腸癌的篩查、輔助診斷和療效判斷，但其存在著診斷靈敏度或特異度不足的缺陷。越來越多的證據(jù)表明，很多遺傳標志對結直腸癌的生物學行為有重要影響，某些基因在腫瘤細胞中的異常表達與腫瘤細胞進展的各個方面，如腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移、抑癌基因的失活等密切相關。骨膜蛋白是一種重要的候選基因，研究發(fā)現(xiàn)其在多種人類腫瘤如結直腸癌、胃癌、肺癌等中均過表達[1-6]。因此，為進一步明確骨膜蛋白在結直腸癌中的診斷價值，了解骨膜蛋白與CEA在結直腸癌患者血清中的表達差異，探索血清骨膜蛋白在結直腸癌診斷及病情判斷中的效能，特開展此研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取菏澤市立醫(yī)院臨床確診結直腸癌患者80例(均為病理診斷確診)為結直腸癌組，所有患者術前均未接受任何化療、放療及生物靶向治療等輔助治療措施，并排除糖尿病、高血壓、腎病等疾病。其中男49例，女31例，年齡29～75歲，中位年齡52歲；結腸癌46例，直腸癌34例；患者Dukes臨床分期：A期15例，B期31例，C期23例，D期11例；病理組織學分型：腺癌53例，黏液癌18例，未分化癌9例。無菌采集患者空腹靜脈血液樣本，室溫靜置30 min，2 500 r/min離心20 min后提取血清，低溫保存?zhèn)溆?。同時選取同期體檢健康者60例作為健康對照組，包括男37例，女23例，年齡27～73歲，中位年齡 50歲，其各項體檢指標均正常。2組在性別、年齡等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，所有結直腸癌患者及健康對照者均知情同意本研究，并經(jīng)菏澤市立醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法 應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELASA，Sigma)法檢測結直腸癌患者和健康對照組血清中骨膜蛋白水平，采用雙抗體夾心法，嚴格按試劑盒說明書操作。主要步驟為：將6種不同水平的Periostin標準品(0.5、1.0、5.0、10.0、30.0、50.0 ng/mL)及健康對照者和結直腸癌患者血清各100 μL分別加至相應孔(每份標準品及待檢標本均做復孔)，將反應板置37 ℃溫箱孵育2 h后，洗板4次。每孔分別加5 μL兔抗人Periostin單克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG，然后置37 ℃溫箱孵育1 h，然后每孔分別加顯色液DAB和H2O2，再置37 ℃溫箱避光顯色20 min，最后加2 mol/L的H2SO4以終止反應。設空白孔為零，于酶標儀450 nm處讀取吸光度值(A值)。以標準品水平為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)樣品A值，從標準曲線上查出相應水平，再乘以稀釋倍數(shù)，計算出待檢血清Periostin水平。應用電化學發(fā)光免疫分析法測定結直腸癌患者和健康對照者血清中CEA水平，原理亦是雙抗夾心法，嚴格按試劑盒說明書要求操作。

2 結 果

2.12組血清骨膜蛋白與CEA檢測結果 結直腸癌組血清中骨膜蛋白和CEA水平均遠高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2結直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平與其臨床病理特征的關系 結直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平表達在不同年齡(≥60歲、<60歲)、不同性別患者中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨患者臨床Dukes分期的增高，患者血清骨膜蛋白和CEA水平逐漸升高，在結直腸癌不同病理組織學類型中，未分化癌血清骨膜蛋白和CEA水平最高，其次是黏液癌和腺癌，腫瘤分化程度越低，骨膜蛋白和CEA水平越高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、3。

表1 2組血清骨膜蛋白與CEA檢測結果

表2 結直腸癌患者血清骨膜蛋白和CEA水平與年齡、性別的關系

表3 結直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平與臨床Dukes分期、病理組織學類型的關系

3 討 論

骨膜蛋白是一種來源于鼠成骨細胞的蛋白質，因其在骨膜和牙周韌帶的定位表達而被稱為骨膜蛋白,由811個氨基酸殘基構成[1]。研究發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中，如乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等，骨膜蛋白均過表達[2-6]。人源骨膜蛋白由836個氨基酸殘基組成，基因定位于第13號染色體長臂上，大小約為36 kb，相對分子質量約為93.33×103，與鼠的氨基酸同源性約為89.2%，具有高度的保守性。骨膜蛋白屬于成束蛋白家族成員，屬分泌性細胞外基質蛋白，它含有1個NH2-末端信號肽序列，1個胱氨酸結構域，4個同源性重復區(qū)(120～160個氨基酸)和1個親水COOH-末端結構域。骨膜蛋白的COOH-末端可與多種細胞外基質蛋白結合,如膠原蛋白、纖維連接蛋白、生腱蛋白-C等，從而發(fā)揮調節(jié)細胞與基質間的組成、相互作用、改變結締組織的生物力學特性構建網(wǎng)狀結構等重要作用。

骨膜蛋白作為αvβ3和αvβ5整合素的配體有助于卵巢上皮細胞的黏附和遷移。骨膜蛋白通過αvβ3整合素激活Akt/PKB標志性通路以增加細胞的生存、黏附及擴散，整合素的表達水平與結直腸癌的轉移和復發(fā)有關[7]。雖然骨膜蛋白在多種腫瘤及結直腸癌中有個別報道，但其在結直腸癌患者血清中的表達研究較少，且未發(fā)現(xiàn)其與常用指標CEA的比較分析，故開展此研究，以期為臨床結直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)尋求更可靠的腫瘤標志物。

CEA是研究者在1965年提取的一種腫瘤相關抗原，最先是從結腸癌和胚胎組織中發(fā)現(xiàn)的。它是一種酸性糖蛋白，且是構成細胞膜的結構蛋白，包含641個氨基酸，存在于內胚層細胞分化而來的腫瘤細胞表面，具有人類胚胎抗原特性。CEA的合成是在胞質中，可穿過細胞膜分泌到細胞外，分布于人體周圍體液中，因此，可從血清、腦脊液、乳汁等多種體液標本中檢出。CEA水平的升高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤中，但吸煙者、妊娠期者和心血管疾病、直腸息肉、結腸炎等多種疾病中，15%～53%的患者血清CEA水平也會升高，故CEA對惡性腫瘤的診斷不具有特異性，雖然已廣泛應用于結直腸癌的篩查、輔助診斷和療效判斷，作為早期檢測大腸癌的傳統(tǒng)血清學腫瘤標志物，但受到其診斷靈敏度或特異度的限制[8]。

本研究通過對結直腸癌患者和健康對照者血清進行骨膜蛋白與CEA的聯(lián)合測定，發(fā)現(xiàn)結直腸癌組患者血清中骨膜蛋白與CEA的水平明顯高于健康對照組，此結果證實CEA在結直腸癌患者血清中的診斷價值，符合臨床結論，但同時也表明骨膜蛋白類似于CEA，在結直腸癌患者血清中的表達明顯增高，同樣對結直腸癌的診斷有重要的參考價值。

基礎研究認為，腫瘤細胞常利用鄰近間質細胞及其所分泌的細胞外基質蛋白重塑出有利于原發(fā)腫瘤生長的微環(huán)境，進而形成便于其侵襲和遷移的轉移灶。也有研究表明，骨膜蛋白可以促進細胞生長及血管生成，增強細胞對低氧的耐受性，在非小細胞肺癌、結腸癌、腎細胞癌、惡性胸膜間皮瘤等中均高表達，具有增強腫瘤細胞增生、遷移和侵襲的能力。本研究對結直腸癌患者血清中骨膜蛋白、CEA水平與其臨床病理特征的關系進行了探討，結果表明，結直腸癌患者血清中骨膜蛋白和CEA水平隨患者臨床Dukes分期進展而升高，這在一定程度上說明越是接近于結直腸癌晚期的患者，其血清中骨膜蛋白和CEA水平亦越高，特別是C期和D期的血清骨膜蛋白水平顯著高于A期和B期，與臨床研究結果相符。因此，血清中骨膜蛋白水平在提示結直腸癌患者具有侵襲和轉移的風險評估中有重要意義，可以作為高風險的臨床指標。但本研究也觀察到，不論處于何種臨床分期和何種腫瘤病理類型的結直腸癌患者，其血清骨膜蛋白和CEA水平與年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。

本研究也發(fā)現(xiàn)，骨膜蛋白和CEA在不同病理組織學類型的表達程度也不同，在未分化癌血清中骨膜蛋白和CEA水平最高，其次是黏液癌和腺癌。低分化型大腸癌血清中骨膜蛋白水平顯著高于中分化、高分化大腸癌，腫瘤分化程度越低，骨膜蛋白和CEA水平越高。此外研究還發(fā)現(xiàn)，血清骨膜蛋白和CEA水平升高的患者發(fā)生遠處器官轉移的概率較高，與臨床報道一致[9-10]，這在判斷腫瘤進展、臨床分期、術后復發(fā)及預后等方面會有一定意義。

綜上所述，骨膜蛋白和CEA在大腸癌的診斷中具有高度的一致性，這2項指標對患者病情評估和預后判斷均有重要參考價值。目前，研究者所用的多數(shù)腫瘤標志物缺乏器官特異性，再加上不同腫瘤組織的復雜性和異質性，單項腫瘤標志物的判斷價值有限，輔助診斷效果不佳，已不能滿足臨床需求。因此，多項標志物聯(lián)合檢測已是診斷腫瘤的一個趨勢。