范志宇,王 芳,胡 波,魏后軍,薛家賓,姜 平

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014)

兔出血癥,俗稱兔瘟,于1984 年首次在江蘇無錫等地發(fā)現(xiàn),之后迅速蔓延至全國各地。當(dāng)前,世界許多國家和地區(qū)均有該病的流行和暴發(fā),給全球養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前,對(duì)兔瘟的預(yù)防,國內(nèi)、外主要用組織滅活疫苗,由于制作組織滅活疫苗的不免疫兔瘟相關(guān)疫苗的家兔數(shù)量有限,因此疫苗抗原的來源比較缺乏,造成國內(nèi)兔瘟疫苗供不應(yīng)求的局面[4]。

本研究對(duì)南京天邦生物科技有限公司中試生產(chǎn)的3 批次兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)在6 家臨床試驗(yàn)兔場(chǎng)開展疫苗免疫期試驗(yàn)等相關(guān)研究工作,完成了該疫苗臨床免疫效力評(píng)估,為該疫苗的新獸藥注冊(cè)申報(bào)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 疫苗 3 批次經(jīng)安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)等項(xiàng)目檢驗(yàn)合格的兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)中試產(chǎn)品(批號(hào)分別為：2013002、2013003、2013004),南京天邦生物科技有限公司中試生產(chǎn);兔病毒性出血癥滅活疫苗(批號(hào)：129083),南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn),2 ℃～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 攻毒毒種 兔出血癥病毒皖阜株肝毒(病毒含量≥105.5LD50/mL,或HA 效價(jià)不低于1∶256),由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離、鑒定、凍干保存。

1.3 臨床試驗(yàn)動(dòng)物 不同品種：獺兔、肉兔、毛兔,不同日齡：35～42 日齡幼兔、2 月齡健康家兔,分別來自江蘇A 兔場(chǎng)、江蘇B 兔場(chǎng)、江蘇C 兔場(chǎng)、山東A 兔場(chǎng)、浙江A 兔場(chǎng)、浙江B 兔場(chǎng)共6 家養(yǎng)殖場(chǎng)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 玻片法血凝試驗(yàn)[5]取少量待檢兔肝臟樣品,置于清潔的載玻片,用剪刀將肝臟樣品剪碎,滴加2 滴～3 滴1%人“O”型紅細(xì)胞于肝臟樣品上,同時(shí)設(shè)立兔出血癥陰、陽性肝臟對(duì)照,輕輕混勻后,于玻片上孵育2 min,若有兔病毒性出血癥病毒,肉眼可直接觀察到玻片出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

2.2 臨床試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇 6 家臨床試驗(yàn)兔場(chǎng)兔群必須精神狀態(tài)健康,食欲、飲欲正常,實(shí)驗(yàn)兔未發(fā)生兔病毒性出血癥,無兔病毒性出血癥臨床癥狀,無其他傳染病,未接種過針對(duì)兔病毒性出血癥的單苗或聯(lián)苗。所有受試兔包括對(duì)照兔(哨兵兔)在開始試驗(yàn)后不再接種針對(duì)兔病毒性出血癥的其他單苗或聯(lián)苗,直至試驗(yàn)結(jié)束。

在江蘇A 兔場(chǎng)、山東A 兔場(chǎng)、江蘇B 兔場(chǎng)進(jìn)行肉兔試驗(yàn),分別在3 家試驗(yàn)兔場(chǎng)選擇35～42 日齡幼兔、2 月齡健康家兔,備用;在浙江A 兔場(chǎng)、浙江B 兔場(chǎng)進(jìn)行獺兔試驗(yàn),分別在2 家試驗(yàn)兔場(chǎng)選擇35～42日齡幼兔、2 月齡健康家兔,備用;在江蘇C 兔場(chǎng)進(jìn)行毛兔試驗(yàn),選擇35～42 日齡幼兔、2 月齡健康家兔,備用。

2.3 動(dòng)物分組和免疫 使用批號(hào)2013002 疫苗分別在江蘇A 兔場(chǎng)、浙江A 兔場(chǎng)、江蘇C 兔場(chǎng)和浙江B 兔場(chǎng)進(jìn)行免疫,使用批號(hào)2013003 疫苗在山東A兔場(chǎng)進(jìn)行免疫,使用批號(hào)2013004 疫苗在江蘇B 兔場(chǎng)進(jìn)行免疫;使用批號(hào)129083 分別在6 家兔場(chǎng)免疫35～42 日齡幼兔和2 月齡健康兔;同時(shí)有一定數(shù)量的不同日齡家兔留作對(duì)照兔,皮下注射滅菌生理鹽水,不接種疫苗。

2.4 臨床效力試驗(yàn) 臨床效力試驗(yàn)過程中對(duì)死亡兔進(jìn)行剖檢,如有疑似兔出血癥癥狀死亡兔要帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病毒檢測(cè),確定是否死于兔出血癥。

2.5 抽檢攻毒試驗(yàn) 分別在注射后第150、210 天分別在6 家試驗(yàn)兔場(chǎng)隨機(jī)選擇中試產(chǎn)品和同類疫苗免疫幼兔和仔兔包括對(duì)照兔,5 只/組/批/次,帶回實(shí)驗(yàn)室,采用攻毒法進(jìn)行效力檢驗(yàn),各皮下注射兔出血癥病毒皖阜株肝毒1 mL,連續(xù)觀察7 日,記錄死亡與保護(hù)的動(dòng)物數(shù)量,對(duì)死亡兔進(jìn)行剖檢觀察并取肝臟進(jìn)行人“O”型紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。

2.6 血清抗體測(cè)定 對(duì)6 家臨床試驗(yàn)兔場(chǎng)1 mL/只免疫的2 月齡兔,每家兔場(chǎng)隨機(jī)選擇10 只,免疫后每隔30 日進(jìn)行1 次血液采集,帶回實(shí)驗(yàn)室分離血清,-20 ℃凍存?zhèn)錂z,連續(xù)采集7 個(gè)月。使用實(shí)驗(yàn)室建立的血凝抑制(HI)方法和ELISA 方法進(jìn)行抗體檢測(cè),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 臨床效力試驗(yàn) 兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)中試產(chǎn)品相繼在江蘇A 兔場(chǎng)、江蘇B 兔場(chǎng)、江蘇C 兔場(chǎng)、山東A 兔場(chǎng)、浙江A兔場(chǎng)、浙江B 兔場(chǎng)共6 家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行中試免疫試驗(yàn),共使用中試產(chǎn)品疫苗免疫家兔29 565 只,其中幼兔24 313 只、2 月齡兔1 820 只、仔兔1 607 只、孕兔1 225 只;使用兔病毒性出血癥滅活疫苗免疫家兔2 400 只,其中幼兔1 200 只,2 月齡兔1 200 只;設(shè)立未免疫對(duì)照兔(崗哨兔)360 只,其中肉兔120只、獺兔180 只,毛兔60 只;以上所有家兔在試驗(yàn)期間均沒有發(fā)生兔出血癥,6 家兔場(chǎng)中試疫苗免疫組、同類疫苗免疫組和對(duì)照組出欄率差異不明顯。說明兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗中試產(chǎn)品可以保護(hù)免疫兔場(chǎng)不發(fā)生兔出血癥。

3.2 抽檢攻毒試驗(yàn) 中試產(chǎn)品和同類產(chǎn)品分別免疫后第150、210 天攻毒,攻毒后進(jìn)行觀察,如果攻毒兔出現(xiàn)以下癥狀為疑似兔出血癥,需用玻片法進(jìn)行凝集試驗(yàn)確診。攻毒兔死前表現(xiàn)短暫的興奮,突然倒地,劃動(dòng)四肢呈游泳狀,瀕死時(shí)抽搐,角弓反張,眼球突出,慘叫幾聲而死,典型病例可見鼻孔流出血樣液體,肛門松弛,肛周有少量淡黃色黏液附著。剖檢可見肺有不同程度充血、瘀血;肝臟淤血、腫大、質(zhì)脆,表面呈淡黃色或灰白色條紋,切面粗糙;脾臟淤血、腫大,呈藍(lán)紫色;腎臟和胸腺水腫、腫大,并有散在性針尖至粟粒大出血點(diǎn)(見中插彩版圖1)。

圖1 典型兔出血癥癥狀和剖檢病變

如出現(xiàn)兔出血癥典型的病理變化,對(duì)死亡兔肝臟懸液作人“O”型紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)進(jìn)行確診。結(jié)果顯示,玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陽性,死亡兔均為兔出血癥特異性死亡(見中插彩版圖2)。

圖2 玻片凝集試驗(yàn)

使用同一批次(批號(hào)2013002)中試產(chǎn)品或同類疫苗免疫肉兔、獺兔、毛兔的免疫期攻毒效力檢驗(yàn),結(jié)果顯示,同批次疫苗對(duì)不同品種家兔均可以產(chǎn)生7 個(gè)月的保護(hù);使用不同批次(批號(hào)2013002、2013003、2013004)中試產(chǎn)品或同類疫苗免疫肉兔進(jìn)行免疫期攻毒,免疫兔均健活,對(duì)照兔至少死亡4只,說明不同批次疫苗對(duì)同一品種也可以產(chǎn)生7 個(gè)月的保護(hù)。結(jié)果說明,兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗的免疫期為7 個(gè)月。見表2。

表1 臨床效力試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 抽檢攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3.3 血清抗體測(cè)定 對(duì)6 家臨床試驗(yàn)兔場(chǎng)1 mL/只免疫的2 月齡兔,將免疫后7 個(gè)月內(nèi)每月采集的血清用血凝抑制(HI)方法和ELISA 方法進(jìn)行抗體檢測(cè),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(見中插彩版圖3 和圖4)。結(jié)果顯示,免疫后1 個(gè)月,家兔血清抗體HI 效價(jià)達(dá)到1∶23.13,免疫后3 個(gè)月,家兔血清抗體HI 效價(jià)達(dá)到高峰,此后逐漸下降,注射疫苗后7 個(gè)月其血清中平均抗體水平仍維持在1∶23以上,對(duì)照組家兔血清抗體平均HI 效價(jià)在1∶2～1∶20.4之間。不同批次疫苗免疫兔和同批次疫苗免疫肉兔血清抗體HI 效價(jià)沒有顯著差異。薛家賓等研究結(jié)果也顯示[6],家兔血清抗體HI 效價(jià)達(dá)到1∶23及以上時(shí),可以100%抵抗RHDV 強(qiáng)毒攻擊。本試驗(yàn)抗體測(cè)定結(jié)果說明,兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗可以產(chǎn)生7 個(gè)月的保護(hù)。

圖3 不同批次疫苗肉兔免疫持續(xù)期血清HI 效價(jià)

圖4 同批次疫苗不同品種家兔免疫持續(xù)期血清HI 效價(jià)

對(duì)臨床試驗(yàn)兔場(chǎng)1 mL/只免疫的2 月齡兔,將免疫后7 個(gè)月內(nèi)每月采集的血清用ELISA 方法進(jìn)行抗體檢測(cè),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(中插彩版圖5 和圖6)。結(jié)果顯示,免疫后1 個(gè)月,家兔免疫組血清ELISA 方法OD450nm平均值達(dá)到0.800 2,與當(dāng)月對(duì)照組血清ELISA 方法OD450nm平均值0.168 5 有顯著差異;免疫后4 個(gè)月,家兔血清ELISA 方法OD450nm平均值達(dá)到高峰,免疫組ELISA 方法OD450nm平均值為1.081 2,對(duì)照組血清ELISA 方法OD450nm平均值為0.125 1;此后3 個(gè)月變化不明顯,注射疫苗后7 個(gè)月其血清ELISA 方法OD450nm平均值仍維持在1.038 8,對(duì)照組家兔所有血清ELISA方法OD450nm平均值為0.160 9,與免疫組有顯著差異。不同批次疫苗免疫兔和同批次疫苗免疫肉兔家兔血清ELISA 方法OD450nm平均值沒有明顯差異。

圖5 不同批次疫苗肉兔免疫持續(xù)期血清ELISA 值

圖6 同批次疫苗不同品種家兔免疫持續(xù)期血清ELISA 值

4 討論

由于市售兔病毒性出血癥滅活疫苗存在種種缺點(diǎn),研究人員對(duì)兔出血癥疫苗的研究逐步轉(zhuǎn)向既有保護(hù)作用,同時(shí)沒有生物安全隱患的基因工程疫苗。近年來,國內(nèi)外開展了大量的相關(guān)研究,試驗(yàn)證明RHDV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60 能在多種載體系統(tǒng)中表達(dá),并可以形成與天然RHDV 病毒粒子免疫原性無任何差異的病毒樣顆粒[7-9]。王芳等通過分子生物學(xué)技術(shù)使兔出血癥病毒衣殼蛋白基因在桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá),試驗(yàn)證明所表達(dá)的衣殼蛋白具有良好的免疫原性[10]。宋艷華等應(yīng)用VP60-ELISA 方法測(cè)定RHDV 特異性抗體,結(jié)果顯示RHDV-VP60 疫苗免疫后VP60 特異性抗體可以在高水平維持240 d[11]。

本研究制備的兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)在6 家臨床試驗(yàn)兔場(chǎng)免疫健康家兔,免疫期間沒有發(fā)生兔出血癥;免疫持續(xù)期抽檢用致死劑量的兔出血癥病毒攻擊保護(hù)率都可以達(dá)100%,結(jié)果顯示,疫苗對(duì)肉兔、獺兔、毛兔免疫期均可以達(dá)到7 個(gè)月。以上結(jié)果表明,兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)臨床效力檢驗(yàn)合格,免疫期為7 個(gè)月,也進(jìn)一步證明了國內(nèi)外學(xué)者的研究報(bào)道[12]。兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗(BAC-VP60 株)于2017 年2 月獲得國家一類新獸藥注冊(cè)證書([2017]新獸藥證字06 號(hào)),該疫苗將替代兔病毒性出血癥滅活疫苗,在兔瘟的免疫防控中起到重要作用,從而促進(jìn)我國家兔疾病防控事業(yè)的健康、持續(xù)、穩(wěn)定發(fā)展。