唐蘭蘭，鄧胤銘，付茜茜，扈正權(quán)，張青碧，霍婷婷，柏 ●

(1． 西南醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 四川 瀘州 646000； 2． 西南科技大學(xué) 固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 綿陽(yáng) 621000； 3． 瀘州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站， 四川 瀘州 646000)

大氣顆粒物PM2.5由于具有粒徑小、比表面積大和易吸附空氣中有毒有害物質(zhì)的特點(diǎn)，會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害。大量研究結(jié)果顯示，空氣中PM2.5的濃度與呼吸系統(tǒng)疾病、哮喘和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)病率、死亡率有緊密的聯(lián)系(Andersonetal., 2012; Gehringetal., 2015; Jacqueminetal., 2015)。PM2.5能深入肺部細(xì)支氣管和肺泡，從而刺激機(jī)體肺部或全身發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激(Brooketal., 2010; 章如新等, 2017; 鹿奎奎等, 2017)，造成肺部損傷。由此可見(jiàn)，PM2.5對(duì)人健康的影響非常嚴(yán)重，應(yīng)受到廣泛關(guān)注。但僅靠環(huán)境污染治理難以在短時(shí)間內(nèi)有所成效，因此，尋找合理有效的抗PM2.5損傷的物質(zhì)就很有必要?，F(xiàn)今，已有維生素E(李莉珊等, 2016)、紅景天(劉平安等, 2015)、富硒酵母(劉潔等, 2017)和阿膠(Liuetal., 2018)等具有抗炎、抗氧化物質(zhì)引入了干預(yù)PM2.5損傷的研究中。有研究表明，PM2.5暴露能使DNA的甲基化發(fā)生改變，而這些改變被認(rèn)為可能是PM2.5誘導(dǎo)機(jī)體炎癥和氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)(Baccarellietal., 2009; Pannietal., 2016)。而DNA甲基化依賴(lài)于能夠提供甲基的營(yíng)養(yǎng)素(如B族維生素的葉酸、B6、B12、蛋氨酸等氨基酸)(Ramchandanietal., 1999; Dolinoyetal., 2006; Cropleyetal., 2007)。因此，如果能防止異常的DNA甲基化或許能夠抑制PM2.5暴露導(dǎo)致的肺部損傷。B族維生素已用在許多肺部疾病的治療中，但用于干預(yù)PM2.5暴露對(duì)機(jī)體損傷的研究還很少。Zhong 等(2017)對(duì)人群的研究結(jié)果顯示復(fù)合維生素B的補(bǔ)充能夠阻止PM2.5暴露導(dǎo)致的線(xiàn)粒體DNA甲基化的改變，但維生素B能否最終減緩PM2.5導(dǎo)致的急性肺損傷還需進(jìn)一步研究。

本研究擬用PM2.5降塵對(duì)SD大鼠進(jìn)行多次非暴露式氣管滴注染毒，給予復(fù)合維生素B(葉酸、B6和B12)灌胃干預(yù)，觀(guān)察大鼠肺部病理變化，收集支氣管肺泡灌洗液測(cè)定總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等指標(biāo)，從而進(jìn)一步觀(guān)察大鼠肺損傷程度的變化，分析復(fù)合維生素B對(duì)PM2.5所致大鼠肺損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為B族維生素應(yīng)用于預(yù)防PM2.5對(duì)健康造成影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑

主要儀器有7200型分光光度計(jì)(優(yōu)尼柯上海儀器公司，F(xiàn)J7200)、酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Spectrum)、5810R冷凍離心機(jī)(Eppendorf，5810R)、數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(3D Hiestech，Pannoramic 250)，試劑包括總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過(guò)氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用8～10周齡的雄性SD大鼠56只，體重180～200 g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(川)2018-065]。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度25±1℃，相對(duì)濕度50±5%，晝夜節(jié)律為12 h晝夜交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上。所有的動(dòng)物研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 PM2.5降塵的采集與懸液制備

PM2.5降塵樣本由西南科技大學(xué)固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將收集到的PM2.5降塵使用臥式行星球磨機(jī)(轉(zhuǎn)速40 Hz)于乙醇中研磨 8 h 后，采用激光粒度分析儀測(cè)定研磨后樣品在水溶液中的分散粒度，結(jié)果顯示大部分粉塵粒徑≤ 2. 5 μm，符合本實(shí)驗(yàn)要求粒度。采用X射線(xiàn)衍射儀對(duì)樣本的物相分析結(jié)果顯示降塵中主要物相為石英(楊潔等, 2017)。將收集到的PM2.5降塵與無(wú)菌生理鹽水混合配制成濃度為0.4、2.0、10.0 mg/mL的PM2.5懸液，低溫避光保存，使用前超聲30 min混勻后使用。

1.1.4 復(fù)合維生素B的配制

干預(yù)組復(fù)合維生素B的濃度參考Zhong 等(2017)的研究。每片復(fù)合維生素B(Webber Naturals, 加拿大產(chǎn))含1 mg葉酸、50 mg維生素B6、125 μg維生素B12，溶于50 mL純凈水，配得維生素B干預(yù)濃度為0.02 mg/mL葉酸、1 mg/mL維生素B6、 0.002 5 mg/mL維生素B12。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組與染毒

設(shè)對(duì)照組、PM2.5低劑量組(0.4 mg/mL)、PM2.5中劑量組(2.0 mg/mL)、PM2.5高劑量組(10.0 mg/mL)、PM2.5低劑量+復(fù)合維生素B組、PM2.5中劑量+復(fù)合維生素B組和PM2.5高劑量+復(fù)合維生素B組，每組大鼠8只，共56只。干預(yù)組和PM2.5組分別以0.01 mL/g的量對(duì)大鼠灌胃復(fù)合維生素B和純凈水28天后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.25 mL/100 g麻醉大鼠，采用非暴露式氣管滴注(柏●等, 2017)進(jìn)行PM2.5染毒，共3次，每次0.5 mL，每次間隔24 h，染毒期間繼續(xù)使用復(fù)合維生素B或純凈水灌胃。空白對(duì)照組用無(wú)菌生理鹽水滴注和純凈水灌胃。

1.2.2 樣本采集及處理

末次染毒后24 h將大鼠麻醉仰臥固定，打開(kāi)胸腔，暴露氣管，灌洗左肺收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)(柏●等, 2017)，1 000 r/min離心10 min，收集上清液于塑料離心管中，分裝標(biāo)記置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取右?cè)肺葉主支氣管周?chē)谓M織，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后，置于福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋后切片，經(jīng)HE(蘇木素-伊紅)染色，用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(Pannoramic 250)觀(guān)察肺組織損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

為進(jìn)一步明確各處理組大鼠肺損傷的病理分級(jí)，根據(jù)Szarka 等(1997)建立的病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將肺損傷狀況分為0～Ⅴ級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表 1 急性肺損傷病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Pathological scoring criteria for acute lung injury

每個(gè)劑量組選取8張病理切片，每片鏡下分別截取2張 200 倍彩圖照片，基于炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度以及肺泡壁增厚程度等病理指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分過(guò)程中嚴(yán)格采用雙盲法進(jìn)行病理分級(jí)。

1.2.3 BALF中TP、LDH、AKP、ACP、MDA、SOD和CAT的測(cè)定

用考馬斯亮藍(lán)法、2,4-二硝基苯肼比色法、分光光度法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法和鉬酸銨法分別測(cè)定BALF中的TP、LDH、AKP、ACP、MDA、SOD和CAT的含量。測(cè)試按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(南京建成生物工程研究所)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)形態(tài)改變

不同劑量的PM2.5對(duì)肺組織形態(tài)學(xué)的改變和復(fù)合維生素B干預(yù)PM2.5所致肺損傷的結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常(圖1a)；PM2.5各劑量組有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間隔增寬，部分肺泡塌陷、融合等不同程度病理性改變，且隨染毒劑量的增加而逐漸加重(圖1b、1d、1f箭頭所示)；而PM2.5各劑量對(duì)應(yīng)的復(fù)合維生素B干預(yù)組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均有所減少，肺間隔及肺泡塌陷、融合等病理改變有不同程度的減輕(圖1c、1e、1g箭頭所示)。

2.2 大鼠肺組織病理分級(jí)

各處理大鼠肺組織病理分級(jí)結(jié)果見(jiàn)表2，秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組相比，PM2.5各劑量染毒組的秩均值均升高，且隨染毒劑量的增加而逐漸升高(P<0.05)；PM2.5中、高劑量+復(fù)合維生素B組與其對(duì)應(yīng)的染毒組相比，秩均值顯著降低(P<0.05)，而PM2.5低劑量+復(fù)合維生素B組與其對(duì)應(yīng)的染毒組相比，秩均值無(wú)顯著差異。

圖 1 大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)改變Fig. 1 The histopathologic change of rats’ lung tissuesa—空白對(duì)照組; b—PM2.5低劑量組; c—PM2.5低劑量+復(fù)合維生素B組; d—PM2.5中劑量組; e—PM2.5中劑量+復(fù)合維生素B組; f—PM2.5高劑量組; g—PM2.5高劑量+復(fù)合維生素B組a—control group; b—low dose of PM2.5 group; c—low dose of PM2.5+vitamin B complex group; d—medium dose of PM2.5 group; e—medium dose of PM2.5+vitamin B complex group; f—high dose of PM2.5 group; g—high dose of PM2.5+vitamin B complex group

分組病理分級(jí)0ⅠⅡⅢⅣⅤ秩均值空白對(duì)照組4400008.5PM2.5低劑量組(0.4 mg/mL)03410026.94?PM2.5低劑量+復(fù)合維生素B組05300021.06PM2.5中劑量組(2 mg/mL)01232039.19?#PM2.5中劑量+復(fù)合維生素B組04310024.75&PM2.5高劑量組(10.0 mg/mL)00114249.13?#&PM2.5高劑量+復(fù)合維生素B組03230029.94$

*—與空白對(duì)照組相比有顯著差異； #—與PM2.5低劑量組相比有顯著差異； &—與PM2.5中劑量組相比有顯著差異； $—與PM2.5高劑量組相比有顯著差異(P<0.05,n=8)。

2.3 大鼠BALF中TP、LDH、ACP和AKP的含量變化

不同劑量的PM2.5及其對(duì)應(yīng)的復(fù)合維生素B處理對(duì)大鼠BALF中TP、LDH、ACP和AKP含量變化的影響如圖2所示。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量的PM2.5暴露可引起大鼠BALF中LDH、AKP、ACP和TP含量顯著升高(P<0.05)，且TP含量隨染毒劑量的增加而升高(P<0.05)；PM2.5低、中、高劑量+復(fù)合維生素B組的LDH和TP含量顯著降低(P<0.05)；PM2.5低、高劑量+復(fù)合維生素B組BALF中ACP含量顯著降低 (P<0.05)；PM2.5中劑量+復(fù)合維生素B組BALF中ACP含量無(wú)顯著改變；僅有PM2.5低劑量+復(fù)合維生素B組AKP含量降低(P<0.05)，其余干預(yù)組AKP含量無(wú)顯著變化。

圖 2 大鼠BALF中TP、LDH、ACP和AKP的含量Fig. 2 The content of TP, LDH, ACP and AKP in BALF*—與空白對(duì)照組相比有顯著差異； #—與PM2.5低劑量組相比有顯著差異； &—與PM2.5中劑量組相比有顯著差異； $—與PM2.5高劑量組相比有顯著差異(P<0.05, n=8)*—significant difference compared with the control group; #—significant difference compared with the low dose of PM2.5 group; &—significant difference compared with the medium dose of PM2.5 group; $—significant difference compared with the high dose of PM2.5 group (P<0.05, n=8)

2.4 大鼠BALF中SOD、MDA和CAT的含量變化

不同劑量的PM2.5及其對(duì)應(yīng)的復(fù)合維生素B處理對(duì)大鼠BALF中MDA、SOD和CAT的含量變化的影響如圖3所示。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量的PM2.5染毒可引起大鼠BALF中MDA含量顯著升高(P<0.05)，而SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，且MDA含量隨染毒劑量的增加而升高(P<0.05)，CAT活性隨染毒劑量的增加而降低(P<0.05)；PM2.5低、中、高劑量+復(fù)合維生素B組中MDA含量顯著降低(P<0.05)，而SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05)。

圖 3 BALF中SOD、MDA和CAT的含量Fig. 3 The content of SOD, MDA and CAT in BALF*—與空白對(duì)照組相比有顯著差異； #—與PM2.5低劑量組相比有顯著差異； &—與PM2.5中劑量組相比有顯著差異； $—與PM2.5高劑量組相比有顯著差異(P<0.05, n=8)*—significant difference compared with the control group; #—significant difference compared with the low dose of PM2.5 group; &—significant difference compared with the medium dose of PM2.5 group; $—significant difference compared with the high dose of PM2.5 group (P<0.05, n=8)

3 討論

PM2.5粒徑小，比表面積大，易于富集空氣中的有毒有害物質(zhì)，通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺泡并沉積，通過(guò)肺泡入血，隨血液流經(jīng)全身，引起肺部和全身發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。急性肺損傷(劉平安等, 2015)是各種直接或間接因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，主要特征為彌漫性肺間質(zhì)和肺泡水腫，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征，至今仍缺乏有效治療方法。因此，尋找合理有效的抗PM2.5損傷的物質(zhì)就很有必要。本研究采用PM2.5降塵對(duì)SD大鼠進(jìn)行多次非暴露式氣管滴注染毒，并給予復(fù)合維生素B(葉酸、B6和B12)灌胃干預(yù)，探討復(fù)合維生素B能否對(duì)PM2.5所致大鼠急性肺損傷起到保護(hù)作用。

TP主要來(lái)源于血漿滲出，是一種滲透性標(biāo)志物，它的水平能夠反映肺部血管通透性的破壞程度，TP的升高提示肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障的完整性受到損傷(錢(qián)春燕等, 2011)，血漿中的總蛋白、白蛋白大量釋放。LDH和AKP是細(xì)胞毒性標(biāo)志物，LDH屬于胞漿酶，它的升高是反映細(xì)胞膜損傷的早期敏感指標(biāo)；AKP是由肺泡Ⅱ型細(xì)胞產(chǎn)生，被認(rèn)為是肺泡Ⅱ型細(xì)胞損傷或増生的一個(gè)特異性的生物標(biāo)志，當(dāng)細(xì)胞膜損傷或者細(xì)胞死亡溶解后，體內(nèi)的生物酶LDH、AKP會(huì)大量釋放(楊凌, 2014)。ACP是一種溶酶體酶，主要存在于巨噬細(xì)胞中，參與肺部的防御反應(yīng)，當(dāng)外界異物侵入肺部時(shí)，肺巨噬細(xì)胞因發(fā)揮吞噬作用而崩解，大量的ACP就會(huì)進(jìn)入肺泡灌洗液(錢(qián)春燕等, 2011)。本研究結(jié)果顯示，PM2.5染毒后，BALF中ACP、AKP、LDH和TP的含量明顯增加，肺部出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間隔增寬，部分肺泡塌陷、融合等病理改變，10.0 mg/mL的PM2.5染毒造成的肺組織病理學(xué)形態(tài)改變最為嚴(yán)重。在取材過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)各組肺組織均有不同程度水腫，病理等級(jí)也隨染毒劑量的增加呈逐漸加重的趨勢(shì)，說(shuō)明PM2.5進(jìn)入肺部后改變肺泡Ⅱ型細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜通透性或使細(xì)胞死亡，導(dǎo)致各種細(xì)胞酶滲出增加，還能破壞肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障，造成肺水腫(Matthayetal., 2002)，甚至使肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，最終導(dǎo)致急性肺損傷發(fā)生。而復(fù)合維生素B的干預(yù)使各染毒劑量的大鼠BALF中的ACP、AKP、LDH和TP的含量均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，肺組織水腫和病理?yè)p傷均有所緩解，降低肺組織病理學(xué)評(píng)分，減緩肺損傷。

上述反應(yīng)可以在一定程度上造成肺損傷，氧化應(yīng)激同樣也是介導(dǎo)肺損傷的重要途徑。當(dāng)機(jī)體受到氧化損傷時(shí)，會(huì)刺激機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，使機(jī)體氧化/抗氧化處于平衡狀態(tài)。有研究表明，當(dāng)給大鼠肺部滴注PM2.5懸液后，由于PM2.5成分中含有大量的重金屬元素，可以使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的自由基，當(dāng)機(jī)體清除自由基的能力無(wú)法代償時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化損傷，使肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MDA和NO等，同時(shí)相關(guān)的抗氧化酶如SOD和CAT的含量或活力降低，加速脂質(zhì)過(guò)氧化(Gomes and Negrato, 2014)，造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體損傷(Gengetal., 2013; 張?jiān)? 2016)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，是反映機(jī)體氧化損傷嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)，SOD和CAT是反映機(jī)體清除氧自由基能力的指標(biāo)，這3個(gè)指標(biāo)常常配合用來(lái)反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平(舒琴, 2013;楊一兵, 2018)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的PM2.5染毒可以使肺泡灌洗液中MDA含量顯著升高，且隨染毒劑量的增加而升高，SOD和CAT活性顯著降低，且CAT活性隨染毒劑量的增加而降低。此結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致(Maciejczyketal., 2010; Gomes and Negrato, 2014; 李莉珊等, 2016; 周艷麗等, 2017; 戚子云等, 2019)。這表明當(dāng)大鼠吸入PM2.5后，肺部氧化和抗氧化平衡被打破，肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜通透性增加，最終引起肺損傷。而復(fù)合維生素B的干預(yù)能在一定程度上逆轉(zhuǎn)此氧化應(yīng)激，使MDA的含量呈降低的趨勢(shì)，SOD和CAT的活力也明顯升高。B族維生素是所有人體組織必不可少的水溶性維生素，人體無(wú)法自行制造合成，必須額外補(bǔ)充，廣泛存在于各種食物中。有研究表明，B族維生素中的葉酸可以通過(guò)調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，刺激DNMTs的mRNA和蛋白表達(dá)，提高DNA總甲基化水平，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展(Wenetal., 2015)。葉酸也可在體內(nèi)經(jīng)一碳循環(huán)轉(zhuǎn)化為SAM。SAM是體內(nèi)活性甲基的主要供體，直接參與DNA甲基化反應(yīng)，進(jìn)而參與調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。維生素B6和B12是這一代謝中必要的輔酶因子，其中任意一個(gè)的缺乏都會(huì)使代謝循環(huán)發(fā)生紊亂，進(jìn)而影響DNA甲基化。有研究表明，異常的DNA甲基化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)(Husnietal., 2016)。因此，此3種B族維生素聯(lián)合使用也許可以阻止PM2.5暴露導(dǎo)致的DNA甲基化的改變，從而減少PM2.5暴露對(duì)機(jī)體的損傷作用，但有關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1) PM2.5降塵能夠破壞肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障和肺泡上皮細(xì)胞，刺激機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的自由基，打破機(jī)體氧化和抗氧化平衡體系，造成大鼠急性肺損傷。

(2) 復(fù)合維生素B能夠減輕PM2.5暴露造成的急性肺損傷，對(duì)機(jī)體起到一定保護(hù)作用。