于廣周 譚文剛 張昊

阿爾茨海默病屬于退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變，并嚴(yán)重危害老年人健康，既往研究顯示氧化應(yīng)激可促進(jìn)退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變發(fā)生［1-2］。因而尋找具有清除氧自由基活性的藥物對(duì)降低退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變發(fā)生率具有重要意義。研究表明水翁花對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［3-4］。但水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制尚未完全闡明。研究表明H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中微小RNA-422a（microRNA-422a，miR-422a）與bcl-w蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-422a可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控bcl-w表達(dá)而參與H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡過(guò)程［5］?；谒袒▽?duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的保護(hù)作用，本研究采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，探討水翁花對(duì)miR-422a表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，分析其可能作用機(jī)制，旨在為臨床治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PC12細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所。水翁花購(gòu)自安徽廣印堂中藥股份有限公司，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定為桃金娘科植物水翁的干燥花蕾。RPMI 1640培養(yǎng)基與胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；30%過(guò)氧化氫（H2O2）購(gòu)自天津富宇試劑有限公司；PBS購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；miR-422a mimics及陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-422a抑制物（anti-miR-422a）及陰性對(duì)照（anti-miR-NC）均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物處理與實(shí)驗(yàn)分組

用不同濃度（100、200、300 nmol/L）的 H2O2處理PC12細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率篩選適宜濃度構(gòu)建H2O2模型。實(shí)驗(yàn)分組：PC12組（正常對(duì)照組）、H2O2模型組（300 nmol/L）、水翁花干預(yù)組（10、20、40、60 mg/L），PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含有 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，除PC12組、H2O2模型組外，其余各組加入相應(yīng)藥物濃度處理12 h，除PC12組外，其余各組加入相同濃度的H2O2處理12 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中又將H2O2模型組PC12細(xì)胞分為miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-422a mimics陰性對(duì)照培養(yǎng)12 h）、miR-422a組（轉(zhuǎn)染miR-422a mimics培養(yǎng)12 h）、水翁花40 mg/L+anti-miR-NC組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照后使用濃度為40 mg/L的水翁花處理12 h）、水翁花40 mg/L+anti-miR-422a組（轉(zhuǎn)染miR-422a抑制物后使用濃度為40 mg/L的水翁花處理12 h），收集各組轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，使用濃度為300 nmol/L的H2O2處理12 h。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

棄舊培養(yǎng)基，用2 mL預(yù)冷PBS洗滌各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞置于無(wú)菌無(wú)酶的EP管內(nèi)，4℃條件下，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，加入1 mL生理鹽水制備細(xì)胞懸液，4℃條件下，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，加入緩沖液，加入 5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，加入5 μL PI，室溫避光染色5 min，于1 h內(nèi)上機(jī)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 檢測(cè)SOD活性

收集各組細(xì)胞，4℃條件下，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，用PBS洗滌3次，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，冰上裂解 10 min，4℃條件下，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞SOD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃條件下，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清（細(xì)胞總蛋白），采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，高溫條件下使蛋白變性，取20 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后將分離蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相關(guān)一抗（稀釋比 1∶1 000）于 4℃封閉 24 h，TBST洗膜，再加入二抗（稀釋比1∶5 000）封閉1 h，加入ECL發(fā)光顯影，置于凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，采用Quantityone軟件檢測(cè)條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-422a表達(dá)水平

采用Trizol法提取PC12細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照qRT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配反應(yīng)體系，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，ddH2O26 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性 15 qs，60℃退火 60 s，72℃延伸 30 s，共循環(huán)40次，放入ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-422a相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)均以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷

與PC12組相比，PC12+H2O2100 nmol/L組、PC12+H2O2200 nmol/L組、PC12+H2O2300 nmol/L組PC12細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖1。由于PC12+H2O2300 nmol/L組PC12細(xì)胞凋亡率較高，因此選取選用H2O2300 nmol/L構(gòu)建損傷模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表1 H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷（±s，n=6）Table 1 Hydrogen peroxide induces PC12 damage in neurons（±s，n=6）

表1 H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷（±s，n=6）Table 1 Hydrogen peroxide induces PC12 damage in neurons（±s，n=6）

與PC12組比較，aP＜0.05。

分組PC12 PC12+H2O2100 nmol/L PC12+H2O2200 nmol/L PC12+H2O2300 nmol/L F值P值SOD(U/mL)17.72±1.68 14.95±1.34a 10.02±1.00a 6.72±0.58a 97.706 0.000凋亡率（%）7.58±0.52 11.23±1.20a 17.21±1.76a 55.78±4.33a 504.091 0.000

圖1 不同濃度的H2O2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡的影響Figure1 Effects of different concentrations of hydrogen peroxide on apoptosis of PC12 neurons

2.2 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡及SOD表達(dá)的影響

用不同濃度的水翁花處理PC12細(xì)胞后使用H2O2（300 nmol/L）干預(yù)細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PC12細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），SOD活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而 Bax蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），且隨著使用劑量的增加而變化（P＜0.05），呈劑量效應(yīng)，見圖2、表2。表明水翁花可抑制H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡，并可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)程度。選用水翁花（40 mg/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12中miR-422a表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與PC12組相比，PC12+H2O2300 nmol/L組PC12細(xì)胞中miR-422a的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；相對(duì)于PC12+H2O2300 nmol/L組，PC12+H2O2300 nmol/L+水翁花40 mg/L組PC12細(xì)胞中miR-422a的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表3。

圖2 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of Pulsatilla chinensis on apoptotic protein expression of PC12 induced by hydrogen peroxide in nerve cells

表2 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡及SOD表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of Herba Anemoniae on Apoptosis and SOD Expression of PC12 Neurons Induced by H2O2（±s，n=6）

表2 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡及SOD表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of Herba Anemoniae on Apoptosis and SOD Expression of PC12 Neurons Induced by H2O2（±s，n=6）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與水翁花 10 mg/L 組比較，bP＜0.05；與水翁花20 mg/L組比較，cP＜0.05。

分組（mg/L）對(duì)照水翁花10水翁花20水翁花40水翁花60 F值P值SOD（U/mL）6.71±0.54 9.66±0.84a 12.01±1.12ab 15.62±1.37abc 16.23±1.41abc 79.023 0.000 Bcl-2蛋白0.26±0.03 0.45±0.04a 0.58±0.06ab 0.76±0.08abc 0.82±0.08abc 82.984 0.000 Bax蛋白1.23±0.12 0.94±0.09a 0.71±0.07ab 0.43±0.04abc 0.37±0.04abc 125.961 0.000凋亡率（%）52.58±4.52 33.93±3.24a 24.81±2.56ab 12.26±1.13abc 10.25±1.01abc 227.141 0.000

表3 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12中miR-422a表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 3 The effect of Herba Pulsatillae on the expression of microRNA-422a in neuron PC12 induced by H2O2（±s，n=6）

表3 水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12中miR-422a表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 3 The effect of Herba Pulsatillae on the expression of microRNA-422a in neuron PC12 induced by H2O2（±s，n=6）

分組PC12 PC12+H2O2300 nmol/L PC12+H2O2300 nmol/L+水翁花40 mg/L F值P值miR-422a 1.12±0.11 0.12±0.01a 0.83±0.08b 256.161 0.000

2.4 過(guò)表達(dá)miR-422a對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡及SOD活性的影響

結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-422a組PC12細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），而Bax蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見圖3、表4。

2.5 抑制miR-422a表達(dá)能逆轉(zhuǎn)水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡、SOD活性的影響

相對(duì)于水翁花40 mg/L+anti-miR-NC組，水翁花40 mg/L+anti-miR-422a組PC12細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），SOD活性與Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見圖4、表5。表明抑制miR-422a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡、SOD活性的影響。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-422a對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of overexpression of microRNA-422a on apoptotic protein expression of PC12 induced by hydrogen peroxide in nerve cells

表4 過(guò)表達(dá)miR-422a對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡及SOD活性的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of over-expression of microRNA-422a in on apoptosis and SOD activity of PC12 neurons induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表4 過(guò)表達(dá)miR-422a對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡及SOD活性的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of over-expression of microRNA-422a in on apoptosis and SOD activity of PC12 neurons induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

與miR-NC組比較，aP＜0.05。

分組miR-NC miR-422a t值P值SOD（U/mL）6.71±0.54 14.37±1.28a 13.506 0.000 Bcl-2蛋白0.26±0.03 0.65±0.06a 14.241 0.000 Bax蛋白1.23±0.12 0.53±0.05a 13.190 0.000凋亡率（%）52.58±4.52 19.71±1.58a 16.815 0.000

圖4 抑制miR-422a表達(dá)能逆轉(zhuǎn)水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Inhibiting the expression of miR-422a reverses the effect of Saussurea chinensis on apoptotic protein expression of PC12 induced by hydrogen peroxide in nerve cells

3 討論

PC12細(xì)胞源自大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，其結(jié)構(gòu)、功能及形態(tài)均與神經(jīng)細(xì)胞相似可被用于神經(jīng)藥理學(xué)方面的研究，H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷是氧化應(yīng)激損傷的經(jīng)典模型，研究表明活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用，而機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)生的H2O2相當(dāng)于活性氧，可加重機(jī)體氧化應(yīng)激損傷［6-7］。天然生產(chǎn)藥物對(duì)清除自由基活性及保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷已成為研究熱點(diǎn)［8］。因此，本研究擬尋找減輕神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的藥物，并探究其可能作用機(jī)制。

表5 抑制miR-422a表達(dá)能逆轉(zhuǎn)水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡、SOD活性的影響（±s，n=6）Table 5 Inhibits the expression of microRNA-422a and reverses the effects of Saussurea chinensis on apoptosis and SOD activity of PC12 neurons induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表5 抑制miR-422a表達(dá)能逆轉(zhuǎn)水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12凋亡、SOD活性的影響（±s，n=6）Table 5 Inhibits the expression of microRNA-422a and reverses the effects of Saussurea chinensis on apoptosis and SOD activity of PC12 neurons induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與水翁花40 mg/L+anti-miR-NC組比較，bP＜0.05。

分組對(duì)照水翁花40 mg/L水翁花40 mg/L+anti-miR-NC水翁花40 mg/L+anti-miR-422a F值P值miR-422a 0.12±0.01 0.83±0.08a 0.84±0.08 0.57±0.06b 165.527 0.000 SOD（U/mL）6.71±0.54 15.62±1.37a 15.84±1.41 9.67±0.99b 95.402 0.000 Bcl-2蛋白0.26±0.03 0.76±0.08a 0.75±0.07 0.48±0.05b 93.864 0.000 Bax蛋白1.23±0.12 0.43±0.04a 0.42±0.04 0.89±0.09b 143.525 0.000凋亡率（%）52.58±4.52 12.26±1.13a 12.19±1.16 22.82±2.22b 312.153 0.000

水翁花屬于廣東地產(chǎn)藥材，具有解暑、清熱解毒、抗炎、陣痛等功效［9］。研究表明水翁花提取物可抑制脂肪酶等生成，還具有抗高血壓、白內(nèi)障、神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷等多種功能［10-11］。本研究采用不同濃度的H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2300 nmol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率較高，因而選取H2O2300 nmol/L構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞損傷模型。用不同濃度的水翁花處理H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而Bax表達(dá)上調(diào)，H2O2可破壞細(xì)胞或線粒體膜性結(jié)構(gòu)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究表明Bcl-2可抑制凋亡蛋白參與凋亡途徑，Bcl-2/Bax比值降低細(xì)胞趨向凋亡［12-13］。本研究結(jié)果提示水翁花可通過(guò)降低Bax表達(dá)表達(dá)及升高Bcl-2表達(dá)而抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。SOD屬于機(jī)體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)，其可清除機(jī)體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的MDA等過(guò)氧化物［14］。本研究結(jié)果表明H2O2可降低自由基清除系統(tǒng)的活力而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，水翁花可增強(qiáng)SOD活性，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

miR-422a是腦組織中特異性miRNA，其可作為缺血性腦卒中、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的診斷標(biāo)志物，還可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡而參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［15-16］。本研究結(jié)果表明H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-422a表達(dá)水平降低，而水翁花可上調(diào)miR-422a表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示上調(diào)miR-422a表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡具有抑制作用，并可增強(qiáng)SOD活性。同時(shí)本研究結(jié)果表明抑制miR-422a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)水翁花對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡及SOD活性的作用。提示水翁花對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有積極調(diào)控作用，并可抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，其可能通過(guò)上調(diào)miR-422a表達(dá)而發(fā)揮作用。

綜上所述，水翁花可通過(guò)上調(diào)miR-422a表達(dá)而減輕H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用水翁花防治氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供理論依據(jù)。但關(guān)于miR-422a下游靶基因及其相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系仍需深入研究。