甘椿椿 金湛 汪琴猛 陳高 金美花

【摘?要】目的：探討延胡索乙素對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞因缺糖缺氧所致?lián)p傷的保護(hù)作用。方法： 建立乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺糖缺氧損傷模型。利用CCK法和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定加藥濃度后，將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分成 6 組：正常組、模型組、延胡索乙素低、中、高治療組（2、4、8 μg/mL ）和陽(yáng)性藥物對(duì)照組尼莫地平（8 μg/mL）。觀察延胡索乙素對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量，細(xì)胞一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）含量，一氧化氮合酶（NOS）、超氧化歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果：與模型組相比，延胡索乙素中、高劑量組均能顯著增加細(xì)胞內(nèi)SOD以及GSH-PX的活性（P<0.01）;能夠顯著減少細(xì)胞內(nèi)LDH外漏以及抑制NOS的活性（P<0.01）;能夠顯著減少細(xì)胞內(nèi)NO以及MDA的生成量（P<0.01）。結(jié)論：延胡索乙素對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的缺糖缺氧損傷顯示出良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】延胡索乙素;海馬神經(jīng)元;缺氧缺糖;抗氧化作用

【中圖分類號(hào)】R285.5?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A?【文章編號(hào)】1007-8517（2019）19-0014-05

Abstract： Objective To investigate the protective effect of tetrahydropalmatine on the injury of suckling rat hippocampal neurons due to hypoxia and sugar deficiency. Methods To establish the model of hypoglycemic anoxic injury in suckling rat hippocampal neurons. CCK method and preliminary experiment were used to determine the drug concentration， the cultured cells were randomly divided into 6 groups： normal group， model group， low， medium and high tetrahydropalmatine treatment group （2， 4， 8 μg/mL） and positive control group nimodipine （8 μg/mL）. To study the effect of tetrahydropalmatine on the release quantities of lactate dehydrogenase（LDH）， nitric oxide（NO） and malondialdehyde （MDA） content， nitric oxide synthase（NOS）， super oxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSH-PX） activities in suckling rat hippocampal neurons; Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry. Results Compared with the model group， the activity of SOD and GSH-PX in the cells were significantly increased in both middle and high dose groups （P<0.01）. It could significantly reduce the intracellular LDH leakage and inhibit the activity of NOS （P<0.01）. The productions of NO and MDA in cells （P<0.01） were reduced by tetrahydropalmatine; It could obviously inhibit early apoptosis of cells; the protein expression levels of caspase-3 and caspase-8 were suppressed by tetrahydropalmatine. Conclusion Tetrahydropalmatine showed a good protective effect on the hypoglycemic anoxia damage in suckling rat hippocampal neurons， and its mechanism may be related to anti-oxidation and inhibition of apoptosis.

Key?words：Tetrahydropalmatine; Suckling Rat Hippocampal Neurons; Hypoxia and Sugar Deficiency; Anti-oxidation

缺血性腦血管病為臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，約占腦血管疾病的85%，其病死率僅次于心臟病、腫瘤，是造成人類死亡的主要疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后大部分血管能自然再通或經(jīng)溶栓治療恢復(fù)再通，但同時(shí)也會(huì)造成進(jìn)一步腦損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注損傷[2]。許多研究證明，很多中藥中的有效成分對(duì)防治腦缺血損傷具有良好的療效，可通過(guò)調(diào)控腦缺血損傷的相關(guān)信號(hào)通路，減少炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等方式減少腦缺血再灌注損傷。

海馬結(jié)構(gòu)正常和功能完整是人類學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，海馬神經(jīng)元損傷與腦卒中認(rèn)知功能障礙的發(fā)病密切相關(guān)[3]。在腦缺血再灌注損傷中，海馬神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最易受累的腦區(qū)，對(duì)于缺血缺氧最為敏感，對(duì)缺血缺氧的耐受性差。取乳鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，既可重現(xiàn)其體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程，也易于使用各種技術(shù)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，能夠直觀反映藥物治療腦缺血再灌注損傷的效果，因此乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞是體外研究腦缺氧缺血再灌注損傷常用的模型[4]。

延胡索為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，具有活血、利氣、止痛的功效，臨床常用于胸脅、脘腹脹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻和跌打腫痛等[5]。延胡索乙素作為延胡索的主要有效成分之一，在藥材以及制劑中常作為控制指標(biāo)。已有研究證明延胡索乙素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管都有一定的預(yù)防和保護(hù)作用[6]。延胡索的中藥復(fù)方制劑有很多，例如玄歸止痛滴丸、玄胡索散等，均有活血止痛的作用，但是關(guān)于腦缺血的研究未見(jiàn)報(bào)到，筆者以體外乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象，探討延胡索乙素對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞因缺糖缺氧所致?lián)p傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)延胡索及其復(fù)方制劑抗腦缺血研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?儀器與材料

1.1?儀器?DMI4000B熒光倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡公司），LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），Molecular Devices SpectraMAX Plus 384酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）。

1.2?藥品與試劑?DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;BCA （bicinchoninic acid）蛋白濃度測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3?動(dòng)物?SD乳鼠，雌雄兼用，1～3日齡，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，許可證號(hào)SCXK（滬） 2008-0016（上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。

2?方法

2.1?海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)[7]?取新生24 h的乳鼠放進(jìn)75%乙醇內(nèi)浸泡消毒，在無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)海馬，充分剪碎，加入同體積0.25% 胰蛋白酶消化20 min，用含10% 胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，處理后放入37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h后全量換液（置換后的培養(yǎng)液由97% Neurobasal，2% B27，1% L-谷氨酰胺組成），之后每3天半量換液。在海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種3 d后加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)8 d后建立海馬神經(jīng)元缺氧缺糖細(xì)胞模型，并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2?實(shí)驗(yàn)分組以及配藥?經(jīng)過(guò)CCK-8（Cell Counting Kit-8）法確定延胡索乙素濃度在0～100 μg/mL內(nèi)是非細(xì)胞毒劑量。取培養(yǎng)8 d生長(zhǎng)成熟的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，分為正常組、模型組、延胡索乙素低、中、高劑量組（2、4、8 μg/mL）、陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平組（8 μg/mL）。按照上述比例配置所需各濃度藥物，除正常組加入無(wú)糖DMEM/F12完全培養(yǎng)基外，其余各組均采用無(wú)糖Earles培養(yǎng)基與相應(yīng)濃度的藥物配置。

2.3?乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧缺糖模型的建立?取培養(yǎng)8 d生長(zhǎng)成熟的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，按1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板，隨后將原培養(yǎng)液吸出，以PBS洗滌兩次，加入含有相應(yīng)濃度藥物的無(wú)糖Earles培養(yǎng)基，除正常組外，其余各組均放置于缺氧裝置中，持續(xù)通入包含95%氮?dú)夂?%二氧化碳的混合氣體，直至充滿裝置，封口膜密封，放入37 °C恒溫箱孵育4 h。4 h后取出，在倒置顯微鏡下觀察每組細(xì)胞形態(tài)。

2.4?生化指標(biāo)的測(cè)定?按照“2.3”所述方法建立海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧缺糖模型，隨后取各組細(xì)胞上清液，同時(shí)收集各組細(xì)胞并破碎，采用BCA法檢測(cè)蛋白含量。按照各試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH含量以及各組細(xì)胞中SOD、GSH-PX、NOS活性和NO、MDA等生化指標(biāo)含量。

2.5?細(xì)胞早期凋亡率的測(cè)定?將培養(yǎng)8 d生長(zhǎng)成熟的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以0.25% 胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，以3×105個(gè)/mL密度接種到12孔板，每孔終體積0.75 mL，分組情況同“2.2”項(xiàng)分組方法一致，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，0.25% 胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS洗兩次，細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。試管中加入100 μL細(xì)胞懸液。加入Annexin V-FITC/PI染料各5 μL后，輕輕混勻，室溫避光放置15 min，最后各試管中分別加入1×Binding-Buffer緩沖液。

2.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理?采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3?結(jié)果

3.1?延胡索乙素對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響?正常組的海馬神經(jīng)元呈錐形或多極性，胞體飽滿清晰、有明顯光暈，有強(qiáng)折光性及立體感;神經(jīng)元突起相互交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞核明顯可見(jiàn)（圖1A）。模型組神經(jīng)元腫脹或變形，突起縮短并逐漸消失，胞質(zhì)內(nèi)顆粒變性明顯、光暈減弱，神經(jīng)元內(nèi)甚至出現(xiàn)了空泡物質(zhì)，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重（圖1B）;延胡索乙素中、高劑量組（4、8 μg/mL）以及陽(yáng)性藥尼莫地平組（8 μg/mL）海馬神經(jīng)元形態(tài)較完整，光暈減弱現(xiàn)象較輕，胞體內(nèi)空泡物質(zhì)減少（圖1D，E和F）。其中延胡索乙素中、高劑量組海馬神經(jīng)元形態(tài)明顯較好，說(shuō)明延胡索乙素能夠明顯降低缺氧缺糖對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損害。如圖1所示。

3.2?延胡索乙素對(duì)相應(yīng)生化指標(biāo)的影響?與正常組相比，模型組的LDH的釋放量增加（P<0.01），而SOD、NOS、GSH-PX的活性降低（P<0.01），同時(shí)NO、MDA的含量明顯增加（P<0.01）。與模型組相比，延胡索乙素的中、高劑量組（4、8 μg/mL）能有效抑制LDH的釋放（P<0.01），且SOD、NOS、GSH-PX的活性增加（P<0.01），同時(shí)NO、MDA的含量顯著降低（P<0.01），但是延胡索乙素的低劑量組的LDH的釋放量，SOD、NOS、GSH-PX的活性與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而NO、MDA的含量與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1、表2。上述延胡索乙素中、高劑量組的生化指標(biāo)的改變證明延胡索乙素能有效改善缺氧缺糖環(huán)境下腦組織的微環(huán)境。

3.3?延胡索乙素對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡的影響?Annexin V-FITC/PC雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在此雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）;右 下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC + /PI-）;右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC + /PI-），詳細(xì)結(jié)果如圖2所示。各組早期細(xì)胞凋亡的數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，與模型組相比，延胡索乙素中、高劑量組能有效抑制細(xì)胞的早期凋亡（P<0.?01），并存在一定的劑量依賴性。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明延胡索乙素中、高劑量組能夠顯著抑制缺氧缺糖損傷海馬神經(jīng)元的早期凋亡進(jìn)程。

4?討論

海馬神經(jīng)細(xì)胞體外生存能力較為脆弱，取材、種植、飼養(yǎng)、消化、凍存過(guò)程中需要注意以下關(guān)鍵環(huán)節(jié)：取材時(shí)為了保持組織的低基礎(chǔ)代謝率，海馬組織需放在冰浴的D-hanks液中。根據(jù)組織塊剪切的大小和量確定加胰蛋白酶的量、濃度、消化時(shí)間等，消化細(xì)胞時(shí)一定要在鏡下觀察消化情況防止消化過(guò)頭。阿糖胞苷需要選取專用于細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的，而非用于臨床治療的[7]。

腦缺血發(fā)生后，多種因素以及多種損失機(jī)制共同影響機(jī)體的各項(xiàng)功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，本研究證明了延胡索乙素能有效減輕由氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致腦缺血損傷。MDA是自由基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損害后，引起生物膜上不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，常用來(lái)反映組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度[8]。而SOD作為目前發(fā)現(xiàn)的人體唯一的負(fù)氧離子天然酶類清除劑，其活性高低亦可間接反映組織自由基的含量[9]。LDH水平的增高是細(xì)胞受損的一個(gè)敏感指標(biāo)，它能一定程度上反映細(xì)胞的損傷程度[10]。GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能清除過(guò)氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈鎖反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[11]。

[JP2]目前研究發(fā)現(xiàn)，NO參與缺血性腦血管疾病的整個(gè)病理生理過(guò)程。在病理狀態(tài)下當(dāng)NO產(chǎn)生過(guò)多時(shí)，它又是一種自由基，可造成膜脂質(zhì)過(guò)氧化并且反應(yīng)生成毒性更大的超氧自由基，引起廣泛的脂質(zhì)過(guò)氧化及蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA損傷。NO參與缺血性腦血管疾病表現(xiàn)為雙重作用，這主要催化NO生物合成的酶NOS所決定的。NOS以L2精氨酸（LZArg）和分子氧為底物，催化兩個(gè)等價(jià)的肌基氮之一，經(jīng)氧化反應(yīng)生成NO和LZ肌氨酸。NOS是NO合成過(guò)程中的重要限速因素，體內(nèi)NO的生物作用完全依賴于NOS的活性[12]。?細(xì)胞凋亡是指機(jī)體受到損傷時(shí)，為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)程序性死亡。Annexin V-FITC/PC雙染色法檢測(cè)以此現(xiàn)象為基礎(chǔ)，對(duì)早期凋亡的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而通過(guò)細(xì)胞凋亡率反映出腦缺血損失的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明延胡索乙素使造模后細(xì)胞內(nèi)SOD活性增加，MDA水平下降，LDH釋放量減少，該結(jié)果表明延胡索乙素對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與抗氧化損傷作用有關(guān)，一定程度上顯現(xiàn)了對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用;延胡索乙素可以使缺氧缺糖時(shí)細(xì)胞內(nèi)GSH-PX水平下降，起到保護(hù)細(xì)胞的作用;一定程度上能降低缺氧缺糖時(shí)NO、NOS的水平。綜上所述，延胡索乙素對(duì)腦缺血損失有非常顯著的保護(hù)作用，它可以保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減少損傷時(shí)細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧自由基的能力，減少脂質(zhì)過(guò)氧終產(chǎn)物的生成，減輕細(xì)胞早期凋亡，有效對(duì)抗腦缺血損失，延胡索乙素在腦缺血疾病的治療中有著非常寬廣的應(yīng)用領(lǐng)域。

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（收稿日期：2019-07-23?編輯：陶希睿）