臭氧處理對交鏈孢菌生長及其毒素積累的抑制作用

姜 楠，王劉慶，李祖梁，王 多，王 蒙,*

（1.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（北京），農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點實驗室，北京 100097；2.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

交鏈孢菌（Alternariaspp.）是污染農(nóng)產(chǎn)品及其制品最普遍的真菌之一，廣泛分布于自然界，其中互隔交鏈孢（Alternaria alternata）是主要的病原菌，其不僅能夠侵染多種農(nóng)作物，引起植物病害（如番茄黑斑病等），而且能夠產(chǎn)生交鏈孢毒素。檢出率較高的交鏈孢毒素包括細交鏈孢酮酸（tenuazonic acid，TeA）、交鏈孢酚（alternariol，AOH）、交鏈孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）等[1-3]。交鏈孢毒素對動植物具有一定的潛在危害，其中AOH具有遺傳毒性和致突變性，還可促使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[4-6]。TeA與AOH、AME具有協(xié)同作用，且均具有動物急性毒性[7]。歐洲食品安全局的數(shù)據(jù)顯示隨膳食攝入的AOH對公眾健康存在風險[8-10]，研究顯示河南省林縣地區(qū)食管癌高發(fā)可能與糧食作物中交鏈孢毒素污染，特別是AOH及其甲基化產(chǎn)物AME含量較高有關(guān)[11-12]。目前食品中的交鏈孢毒素污染已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題，因此掌握有效抑制交鏈孢菌生長及其產(chǎn)毒的防控方法具有重要意義。

臭氧作為強氧化劑，可迅速破壞有機物中的雙鍵，形成含雙鍵少、分子質(zhì)量較低的物質(zhì)；且低劑量臭氧作用于糧食、果蔬等農(nóng)產(chǎn)品表面即可起到殺菌消毒的作用[13]。臭氧可自動分解為氧氣，無毒性殘留，早在1997年，美國食品藥品監(jiān)督管理局就將臭氧作為一種普遍認為安全的方法應(yīng)用于食品加工過程中，目前臭氧已在食品加工貯藏、果蔬保鮮、廢水處理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[14]。臭氧處理還可以殺滅真菌、有效破壞毒素的化學結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)降解毒素的目的。近年來，臭氧用于防控產(chǎn)毒真菌、降解真菌毒素的研究多有報道。Mylona等研究發(fā)現(xiàn)臭氧氣體不僅在體外可抑制輪枝鐮刀菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)，同時可抑制在玉米粉中伏馬毒素（fumonisin B，F(xiàn)B）的積累[15]。Savi等的研究表明臭氧處理可以抑制禾谷鐮刀菌的生長，同時可有效降解小麥粒中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）[16]。此外，還有研究報道臭氧用于降解花生及紅辣椒中的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）[17-18]、蘋果汁中的展青霉素[19]、玉米中的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）以及赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）[20]等。一些臭氧對互隔交鏈孢影響的研究也表明臭氧處理可抑制互隔交鏈孢的孢子萌發(fā)及菌絲生物量生長[21-22]。然而，鮮見臭氧處理拮抗交鏈孢產(chǎn)毒以及其直接降解毒素的研究。鑒于此，本研究不僅考察不同劑量的臭氧處理對體外互隔交鏈孢生長及產(chǎn)毒能力的影響；而且通過接種番茄研究臭氧處理后互隔交鏈孢在番茄活體內(nèi)的致病能力及產(chǎn)毒情況，同時分析了臭氧對交鏈孢毒素的直接降解效果，以期為利用臭氧防控互隔交鏈孢侵染及其毒素積累提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅熟番茄（Solanum lycopersicumcv. Shengfan15）采于北京天安農(nóng)業(yè)有限公司的番茄園，當天運回實驗室，選擇大小均一、同一成熟度、果形端正、無機械損傷和病蟲害的番茄果實作為實驗用果。將番茄果實經(jīng)體積分數(shù)1%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，隨后沖洗，自然晾干備用。

交鏈孢毒素標準品（AOH、AME、TeA）（純度均大于99%） 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（均為質(zhì)譜級） 美國Fisher公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 美國Becton公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTM超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀、電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）檢測器 美國Waters公司；3-30k臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；N-EVA-112P氮吹儀 美國Organomation公司；A11分析研磨機、漩渦混合器 德國IKA公司；Milli-Q A10超純水器 美國Millipore公司；QJ-8006K臭氧發(fā)生器 廣州銓聚臭氧科技有限公司；APES-O3臭氧檢測儀 深圳安帕爾科技有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 互隔交鏈孢培養(yǎng)及孢子懸浮液配制

本研究所用的互隔交鏈孢為本實驗室前期從番茄上分離純化得到的菌株，將互隔交鏈孢接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)10 d。然后用體積分數(shù)為0.05%的Tween-80溶液沖洗平板，采用血球計數(shù)板法制成濃度約為1×105個/mL的孢子懸浮液。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 臭氧處理互隔交鏈孢孢子懸浮液

參考文獻[23]的方法并有所修改。分別吸取2 mL交鏈孢菌孢子懸浮液置于25 mL小燒杯中（燒杯直徑為5 cm），將裝有孢子懸浮液的小燒杯放入已消毒的密閉貯藏箱（48 cm×28 cm×28 cm）中，同時將臭氧檢測器置于貯藏箱中，在室溫條件下通入臭氧氣體，控制臭氧發(fā)生器使箱內(nèi)臭氧質(zhì)量濃度分別為5、10、20 mg/L，處理30 min。處理結(jié)束后回收燒杯內(nèi)的孢子懸浮液，以不經(jīng)臭氧處理的孢子懸浮液作為對照，分別接種于PDA培養(yǎng)基及番茄果實上。

接種PDA培養(yǎng)基：分別吸取對照及不同質(zhì)量濃度臭氧處理后的交鏈孢菌孢子懸浮液20 μL接種于PDA平板上，25 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)7 d，每組接種5 個平板，分別于第3、5、7天用游標卡尺十字交叉測量菌落直徑，并于第7天取1/4培養(yǎng)基進行交鏈孢毒素的提取及測定，實驗重復3 次。

接種番茄果實：接種前用直徑3 mm、已滅菌的不銹鋼釘子在番茄赤道部位刺入1 個傷口（3 mm×3 mm），待傷口表面晾干后分別吸取對照及不同質(zhì)量濃度臭氧處理后的交鏈孢菌孢子懸浮液20 μL接種于番茄果實上，每組設(shè)置15 個番茄，接種后放置在室溫為20 ℃的環(huán)境中貯藏7 d，分別于第3、5、7天用游標卡尺十字交叉測量病斑部位的直徑，并于第7天在病斑部位處取樣。將病斑部位樣品用研磨機混合勻漿，貯存于－20 ℃待測定交鏈孢毒素含量，實驗重復3 次。

1.3.2.2 臭氧處理交鏈孢毒素標準品

參考文獻[14]的方法并有所修改。將TeA、AOH、AME 3 種交鏈孢毒素標準品用乙腈稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標準溶液，分別吸取1 mL標準溶液置于25 mL小燒杯中（燒杯直徑為5 cm）。將裝有毒素標準溶液的小燒杯放入已消毒的密閉貯藏箱（48 cm×28 cm×28 cm）中，同時將臭氧檢測器置于貯藏箱中，在室溫條件下通入臭氧氣體，控制臭氧發(fā)生器使箱內(nèi)臭氧質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、40 mg/L，處理30 min；另外，固定臭氧質(zhì)量濃度為20 mg/L，分別處理毒素標準溶液15、30、45、60、90、120 min。處理結(jié)束后，回收燒杯內(nèi)的毒素標準溶液，利用UPLC-MS/MS進行測定，以不經(jīng)臭氧處理的毒素標準溶液作為對照，每個處理組設(shè)置3 個平行，實驗重復3 次，考察不同臭氧質(zhì)量濃度及處理時間對交鏈孢毒素的降解作用。臭氧處理交鏈孢毒素降解率按下式計算。

式中：c（A,t）為交鏈孢毒素經(jīng)臭氧處理時間t后的含量/（μg/kg）；c（A,0）為交鏈孢毒素的初始含量/（μg/kg）。

1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察互隔交鏈孢的微觀形態(tài)

參考文獻[24]的方法并有所修改。為進一步研究臭氧對互隔交鏈孢孢子和菌絲形態(tài)的影響，對其進行掃描電子顯微鏡觀察。選擇10、20 mg/L臭氧處理后的孢子懸浮液接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)24 h后在菌落周圍插入滅菌的玻璃片，培養(yǎng)24 h后取出玻璃片。將長有交鏈孢菌的玻璃片置于戊二醛溶液中固定2～12 h，用0.1 mol/L pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗2 次，每次10 min；依次用體積分數(shù)20%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液梯度洗脫，每次15 min，再用無水乙醇洗脫2 次，每次15 min；最后用叔丁醇置換，每次30 min，共置換3 次，最后一次置于4 ℃冰箱里，待叔丁醇凝固后冷凍干燥，隨后進行掃描電子顯微鏡觀察，以不經(jīng)臭氧處理組為對照，實驗重復3 次。

1.3.4 交鏈孢毒素含量的測定

交鏈孢毒素的提取及含量測定參考本課題組前期研究的方法[25]，并略有修改。取番茄病斑樣品（5 g）及1/4 PDA培養(yǎng)基樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入20 mL含有體積分數(shù)1%甲酸的乙腈溶液，漩渦混勻，經(jīng)150 r/min常溫振蕩提取30 min，漩渦振蕩后經(jīng)高速冷凍離心機離心（1 000 r/min、10 min、10 ℃），離心完成后取1 mL上清液于40～50 ℃條件下氮氣吹至近干，隨后用1 mL乙腈溶液（體積比3∶7）復溶，混勻后過0.22 μm PTFE微孔濾膜，經(jīng)UPLC-MS/MS測定，每個樣品設(shè)定3 個平行，實驗重復3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

實驗中所有數(shù)據(jù)的方差分析及多重比較均采用SPSS 23.0軟件進行，用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05），采用Gaphpad prism軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理對互隔交鏈孢菌落直徑的抑制

表1所示為臭氧處理互隔交鏈孢孢子懸浮液后接種到PDA培養(yǎng)基上，隨著貯藏時間的延長不同臭氧質(zhì)量濃度處理對互隔交鏈孢菌落直徑的抑制情況。從表1可以看出，臭氧氣體對互隔交鏈孢菌絲的生長有較大程度的延緩和抑制作用，處理組的菌落比對照組生長顯著減慢（P＜0.05）。同時可以看出，抑制作用與臭氧質(zhì)量濃度有關(guān)，隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加，其對互隔交鏈孢菌落直徑的抑制作用明顯加強，互隔交鏈孢菌絲生物量積累逐漸減小。在培養(yǎng)第7天，對照組的菌落直徑為6.88 cm，此時臭氧質(zhì)量濃度為10 mg/L的處理組菌落直徑為5.58 cm，臭氧質(zhì)量濃度為20 mg/L的處理組菌落直徑僅為5.10 cm，顯著低于對照組及低質(zhì)量濃度的臭氧處理組（P＜0.05），其對互隔交鏈孢生長的抑制率分別為18.9%和25.9%。

表 1 臭氧處理對交鏈孢菌生長的抑制情況Table 1 Inhibitory effect of ozone on mycelial growth of A. alternata

臭氧直接作用于互隔交鏈孢孢子懸浮液，導致其生長受到抑制，這可能是因為臭氧的強氧化作用直接使分生孢子失活，使其完全喪失萌發(fā)能力；或者臭氧破壞了分生孢子的細胞結(jié)構(gòu)，從而使健康的分生孢子數(shù)量減小，進而導致菌落生長緩慢。本研究結(jié)果與文獻報道一致，Ames等[21]將互隔交鏈孢長期置于低含量臭氧氣體（150 nL/L）中，隨著暴露時間的延長，互隔交鏈孢的菌落直徑生長逐漸減慢、分生孢子數(shù)量逐漸減小，在100 d時分生孢子全部失活。Tzortzakis等也研究了不同濃度的臭氧熏蒸對交鏈孢菌的菌絲生物量及分生孢子的影響，結(jié)果表明臭氧處理后互隔交鏈孢的菌絲生物量及分生孢子活力均受到顯著抑制，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加抑制作用顯著增強；同時，他們指出臭氧對真菌孢子的抑制作用也與孢子形態(tài)、水分含量、生長基質(zhì)有關(guān)，具體的抑制機理還有待研究[22]。

2.2 臭氧處理對互隔交鏈孢菌絲及孢子形態(tài)的影響

為了進一步考察臭氧處理對互隔交鏈孢造成的破壞，采用掃描電子顯微鏡觀察臭氧處理后的互隔交鏈孢菌絲及孢子的形態(tài)變化情況。如圖1所示，與對照相比，臭氧處理后的互隔交鏈孢形態(tài)發(fā)生異常。正常的互隔交鏈孢孢子呈完整、豐滿的卵形、倒梨形或近似橢球形，表面光滑或具微刺，菌絲表面濃厚光滑，自然伸長。經(jīng)10 mg/L臭氧處理30 min后互隔交鏈孢孢子發(fā)生很明顯的凹陷、褶皺，菌絲變得干癟、萎縮、粗糙，同時出現(xiàn)斷裂的情況；臭氧質(zhì)量濃度增大到20 mg/L時，菌絲和孢子形態(tài)異常程度也逐漸增大，除了明顯的凹陷和褶皺外，孢子表面還發(fā)生破裂，菌絲更加干癟粗糙，且出現(xiàn)不規(guī)則的折疊、皺縮，同時有些孢子和菌絲表面出現(xiàn)小囊泡，由此可見臭氧對互隔交鏈孢的菌絲及孢子的破壞作用與臭氧質(zhì)量濃度有關(guān)。

圖 1 掃描電子顯微鏡觀察臭氧處理后互隔交鏈孢的微觀形態(tài)Fig. 1 SEM observation of A. alternata after ozone treatment

當真菌暴露在不利于生長的環(huán)境（如化學處理、低溫、高濕等）中就會出現(xiàn)分生孢子減少、菌落生長緩慢等現(xiàn)象[26-27]。雖然目前尚鮮見臭氧對互隔交鏈孢形態(tài)學影響的研究報道，但Savi等[28]研究了臭氧對鐮刀菌（Fusarium）、曲霉菌（Aspergillus）以及青霉菌（Penicillium）等真菌形態(tài)學的影響，以上3 種真菌經(jīng)過臭氧處理后在形態(tài)上均表現(xiàn)出異常，菌絲出現(xiàn)變形、破裂。郭宇歡等[23]將灰葡萄孢（Botrytis cinerea）暴露于臭氧氣體中，發(fā)現(xiàn)菌絲表面出現(xiàn)溝壑，說明臭氧處理對灰葡萄孢菌絲造成傷害。在本研究中，一方面，臭氧對互隔交鏈孢的破壞可能是因為強氧化作用直接導致大量孢子及菌絲發(fā)生破壞，進而引起真菌死亡；另一方面，臭氧的強氧化作用可能使細胞壁上的蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、葡聚糖等物質(zhì)發(fā)生化學作用，改變細胞壁的完整性，使細胞內(nèi)容物釋放，進而導致真菌細胞遭到破壞[29]。

2.3 臭氧處理對體外互隔交鏈孢產(chǎn)毒能力的影響

圖 2 經(jīng)臭氧處理后互隔交鏈孢在體外PDA培養(yǎng)基上所產(chǎn)毒素含量Fig. 2 Concentrations of various mycotoxins produced by A. alternata with ozone treatment when cultured on PDA plates

不同質(zhì)量濃度臭氧處理互隔交鏈孢孢子懸浮液后接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下避光生長7 d，第7天進行交鏈孢毒素的提取及含量測定，圖2所示為體外PDA培養(yǎng)基上交鏈孢毒素含量的變化情況。對照組互隔交鏈孢高產(chǎn)TeA（1.08 mg/cm2），AOH（0.071 mg/cm2）、AME（0.009 mg/cm2）含量相對較低。本研究結(jié)果表明臭氧處理可顯著抑制A.alternata產(chǎn)TeA、AOH、AME這3 種交鏈孢毒素，且與臭氧質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在低質(zhì)量濃度臭氧（5 mg/L）處理時，TeA含量為0.88 mg/cm2，AOH含量為0.065 mg/cm2，均低于對照組，而AME不再產(chǎn)生。隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加，TeA和AOH的含量也逐漸降低，當臭氧質(zhì)量濃度增加至20 mg/L時，TeA含量減少至0.71 mg/cm2，與對照組相比減少了34.3%；AOH的含量減少至0.033 mg/cm2，比對照減少了53.5%。

交鏈孢毒素含量的降低可能是因為互隔交鏈孢經(jīng)臭氧處理后菌絲和孢子受到損傷，導致總的生物量減少，進而導致產(chǎn)生毒素的含量有所降低。目前尚鮮見臭氧處理對互隔交鏈孢體外產(chǎn)毒影響的研究，但有臭氧對其他真菌產(chǎn)毒的文獻報道。Mylona等[15]將長有輪枝鐮刀菌的培養(yǎng)基暴露于臭氧氣體中（100×10－6、200×10－6，1 h），10 d后，與對照相比輪枝鐮刀菌FB產(chǎn)量顯著降低。關(guān)于臭氧能抑制真菌產(chǎn)毒的機理，有研究認為是因為臭氧作用使真菌的細胞膜完整性以及參與多種化學反應(yīng)的酶遭到破壞[30]，而本研究也發(fā)現(xiàn)臭氧能夠有效地破壞互隔交鏈孢細胞結(jié)構(gòu)，進而減少毒素的合成，然而關(guān)于臭氧抑制互隔交鏈孢產(chǎn)毒的詳細機制還有待進一步研究。

2.4 臭氧處理對互隔交鏈孢致病能力及產(chǎn)毒能力的影響

互隔交鏈孢是引起番茄黑斑病的主要病害之一，并且會在番茄果實體內(nèi)積累產(chǎn)生交鏈孢毒素，這對番茄及其加工制品的食用安全造成較大威脅。基于此，本研究選擇番茄為基質(zhì)，將臭氧處理后的互隔交鏈孢接種到健康番茄體內(nèi)，觀察互隔交鏈孢在番茄上生長的病斑直徑大小以及產(chǎn)毒的變化情況。

表 2 經(jīng)臭氧處理后的交鏈孢菌在番茄上的生長情況Table 2 Mycelial growth of A. alternata with ozone treatment on tomato fruit

不同質(zhì)量濃度臭氧處理互隔交鏈孢后接種到番茄果實上，第3、5、7天的病斑直徑如表2所示。隨著生長時間的延長，互隔交鏈孢病斑直徑逐漸擴大，臭氧處理導致病斑延伸較對照顯著放緩（P＜0.05），且不同質(zhì)量濃度的臭氧處理組之間也表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。隨著臭氧質(zhì)量濃度的增大，互隔交鏈孢在番茄果實上生長受抑制程度逐漸增大，說明臭氧處理對互隔交鏈孢致病力有較明顯的抑制作用，且臭氧質(zhì)量濃度與致病力呈負相關(guān)。龍君[31]用不同質(zhì)量濃度（50、100、150、200 mg/m3）臭氧氣體熏蒸意大利青霉（Penicillium italicum），隨后接種到柑橘上觀察柑橘的發(fā)病情況，實驗結(jié)果表明臭氧熏蒸后柑橘青霉菌分生孢子的致病力與對照組相比有顯著差異，臭氧氣體既能夠抑制柑橘發(fā)病，也能夠延緩病斑的擴展。這與本研究結(jié)果類似，臭氧處理組均表現(xiàn)出對果蔬病原菌的拮抗作用，能夠抑制病害的發(fā)生。

圖 3 臭氧處理后番茄病斑部位的交鏈孢毒素含量Fig. 3 Concentrations of various Alternaria toxins in lesions of tomato fruit inoculated with A. alternata with ozone treatment

圖3所示為臭氧處理后的互隔交鏈孢在番茄果實上生長第7天的產(chǎn)毒情況。對照組互隔交鏈孢在番茄基質(zhì)上產(chǎn)TeA、AOH、AME的含量分別為172.50、3.18、2.22 mg/kg。與對照組相比，臭氧處理組中3 種交鏈孢毒素的含量均有所下降，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增大，毒素含量顯著降低（P＜0.05），說明臭氧處理對互隔交鏈孢產(chǎn)毒能力具有干預(yù)作用，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增大，抑制產(chǎn)毒能力逐漸增強。然而，臭氧處理對互隔交鏈孢產(chǎn)3 種毒素的抑制能力有所差異，經(jīng)20 mg/L臭氧處理的番茄果實貯藏7 d后，TeA的含量為110.2 mg/kg，比對照組減少了36.1%；而AOH和AME的含量分別為0.32 mg/kg和0.15 mg/kg，分別比對照組減少了89.9%和93.2%，可見臭氧處理抑制該菌株產(chǎn)AOH和AME毒素的作用更明顯。這說明臭氧處理對互隔交鏈孢的菌絲和孢子造成破壞，導致其不能在番茄上正常生長，進而引起交鏈孢毒素的積累減少；而不同交鏈孢毒素之間抑制率的明顯差異又顯示出臭氧處理對互隔交鏈孢產(chǎn)毒的影響不單是緣于對互隔交鏈孢的抑制，也可能存在其他機制影響毒素的合成。

番茄果實富含酚酸，主要有綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸等[32]，同時有研究表明互隔交鏈孢接種到番茄上會引起酚酸含量的變化，而且體外抑菌實驗也表明綠原酸及咖啡酸對互隔交鏈孢生長的抑制率分別是16%、30%[33]。Pane等的研究表明花椒中多酚提取物對采后互隔交鏈孢侵染櫻桃番茄具有抑制作用[34]。酚酸不僅抑制病原真菌生長，對真菌毒素的積累也具有抑制作用，本課題組前期的研究結(jié)果表明，對香豆酸、咖啡酸可以顯著抑制互隔交鏈孢的生長及TeA的產(chǎn)生[35]。另外也有研究表明0.5 mmol/L綠原酸及阿魏酸可使輪枝鐮刀菌產(chǎn)T-2毒素分別減少23.1%及26.5%[36]。酚酸是植物防御體系的組成部分，互隔交鏈孢在番茄上的致病力及產(chǎn)毒能力受到抑制可能是由于臭氧和酚酸協(xié)同作用的結(jié)果，但是不同酚酸成分對交鏈孢毒素的抑制效果及防御機理還需進一步研究。

2.5 臭氧處理對交鏈孢毒素的降解作用

圖 4 臭氧處理交鏈孢毒素的降解效果Fig. 4 Degradation of Alternaria toxins by ozone treatment

臭氧因其強氧化作用可以降解真菌毒素或改變其化學結(jié)構(gòu)，使其毒性基團遭到破壞，從而起到解毒作用。目前眾多研究都表明臭氧對谷物中的AFB1、OTA、ZEN等具有良好的降解效果，但是對交鏈孢毒素的降解效果鮮見報道。圖4為不同臭氧質(zhì)量濃度及處理時間對TeA、AOH、AME 3 種交鏈孢毒素的降解效果。從圖4A可以看出，TeA、AOH、AME 3 種交鏈孢毒素的降解率隨臭氧質(zhì)量濃度的增大而逐漸升高，其中TeA經(jīng)20 mg/L臭氧處理30 min后已檢測不到；AOH在較低臭氧質(zhì)量濃度下降解效果就比較顯著，臭氧質(zhì)量濃度為2 mg/L時降解率為56.0%，臭氧質(zhì)量濃度增大至40 mg/L時降解率為75.0%，降解率變化幅度不明顯；而AME在較低臭氧質(zhì)量濃度時降解效果不明顯，臭氧質(zhì)量濃度增大至40 mg/L時降解率為63.3%。從圖4B中可以看出，當臭氧質(zhì)量濃度固定為20 mg/L時，隨著處理時間的延長，交鏈孢毒素的降解率也逐漸增大，對TeA的降解效果最顯著，在15 min時降解率達63.5%，隨著時間延長，到30 min時可被完全降解；AOH在45 min時降解率為78.8%，在60 min時降解率為79.5%，在此時間段降解率變化不顯著，隨著時間進一步延長，至120 min時降解率達91.9%；AME在較短時間內(nèi)降解效果較差，45 min時降解率僅為47.6%，長時間臭氧處理可較大程度上降解AME，臭氧處理120 min時其降解率達到90.0%。

從兩組實驗結(jié)果來看，處理時間對3 種交鏈孢毒素降解效率的影響占主導因素，除了TeA在較短時間就可降解以外，AOH及AME在20 mg/L處理60 min時降解率即可達70%以上。與文獻報道的臭氧處理其他真菌毒素相比，3 種交鏈孢毒素的臭氧處理時間較長、所需臭氧質(zhì)量濃度較高。Qi Lijun等[20]研究了不同質(zhì)量濃度臭氧及時間處理ZEN及OTA的效果，5 mg/L臭氧處理ZEN標準溶液5 s，其降解率超過90%；10 mg/L臭氧處理OTA標準溶液10 s，其降解率接近50%。王莉等[14]用質(zhì)量濃度為10 mg/L的臭氧氣體降解DON，結(jié)果表明隨著處理時間的延長，DON的降解率也隨之提高，處理5 min后DON降解率達到88%。由此可見，臭氧質(zhì)量濃度、處理時間、毒素的初始濃度、水分含量、pH值等因素都會不同程度地影響臭氧降解真菌毒素的效果[37]。另外，臭氧對真菌毒素的降解效果也與其結(jié)構(gòu)和特性有關(guān)，臭氧具有強氧化作用，一般會攻擊雙鍵結(jié)構(gòu)發(fā)生加成反應(yīng)，也可能會破壞苯環(huán)結(jié)構(gòu)。現(xiàn)有研究認為關(guān)于臭氧降解AFB1、DON、ZEN的機理主要為Criegee機制[14,38-39]，但是關(guān)于交鏈孢毒素的臭氧降解產(chǎn)物鑒定、降解路徑解析、產(chǎn)物安全性評價等方面還需開展深入研究。

3 結(jié) 論

臭氧作為一種強效的氧化劑，因其極易分解生成氧氣、無污染殘留等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食品加工貯藏、果蔬保鮮等領(lǐng)域。本研究結(jié)果表明臭氧處理可導致互隔交鏈孢菌絲干癟萎縮和孢子凹陷褶皺，從而導致其在離體時表現(xiàn)為生長受到抑制，番茄果實上表現(xiàn)為致病力減弱，進而引起互隔交鏈孢產(chǎn)TeA、AOH、AME 3 種毒素能力的降低。同時，臭氧處理還能降解3 種交鏈孢毒素，隨臭氧質(zhì)量濃度的增加及作用時間的延長，其對交鏈孢毒素的降解能力逐漸增加，如TeA經(jīng)過20 mg/L臭氧處理15 min就可以被大量降解，降解率為63.5%，AOH及AME在20 mg/L時臭氧處理60 min，降解率可達70%以上。此外，眾多研究已表明臭氧對病原真菌的生長及其毒素積累均具有較強的抑制作用。因此，臭氧技術(shù)可以作為農(nóng)產(chǎn)品及其制品中互隔交鏈孢及其毒素污染的防治手段。本研究初步探索了臭氧技術(shù)對互隔交鏈孢及其產(chǎn)毒能力的影響，下一步將深入研究臭氧抑制互隔交鏈孢產(chǎn)毒的機理，鑒定臭氧降解交鏈孢毒素的降解產(chǎn)物，解析降解路徑并評價降解產(chǎn)物的安全性，以期為開展果蔬貯藏加工過程中利用臭氧防控交鏈孢毒素污染提供科學依據(jù)和技術(shù)支撐。