快速直接PCR 檢測豬肺炎支原體方法的建立及其應用

徐引弟，張青嫻，王治方，焦文強，李海利，朱文豪，王克領

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal Pneumonia of Swine,MPS），又稱豬地方流行性肺炎（Swine Enzootic Pneumonia），俗稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病。主要臨診癥狀為咳嗽、氣喘、呼吸困難、日增重減少、食欲不振，長期生長不良，飼料報酬大幅下降。肺組織的病理變化特征主要是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉樣實變。本病廣泛分布于世界各地，主要為慢性、高接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率的主要特點。該病常與其他呼吸道病原體如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等病原協(xié)同引起繼發(fā)性感染肺炎，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環(huán)病毒2 型協(xié)同感染引起豬呼吸道病綜合征[1-2]。

豬肺炎支原體不但能引起豬地方流行性肺炎，還是豬呼吸道病綜合征的一種原發(fā)性病原。支原體只要持續(xù)存在，就可導致呼吸道疾病的發(fā)生，并且也可導致其它疫苗免疫失敗。豬支原體病流行于世界各地，不僅在我國存在，在畜牧業(yè)發(fā)達的美國、澳大利亞等國也普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前控制該病的主要措施為疫苗免疫和豬場支原體的凈化等手段。

本研究旨在建立豬肺炎支原體快速直接PCR檢測方法，用于河南省豬場發(fā)生呼吸道疾病的豬肺炎支原體的鑒定，從而為豬肺炎支原體的流行病學、綜合防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料與參考毒株

病料：2017 年1 月至2018 年12 月在河南省大中型豬場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難、肺發(fā)生實變豬的肺臟348 份。陽性對照為豬肺炎支原體168 疫苗株，購自南京天邦生物公司。

1.2 主要試劑和酶

瓊脂糖、DL 2 000 Marker、T5 Direct PCR Kit（動物組織）購自擎科生物技術（北京）有限公司。

1.3 PCR 方法的建立

1.3.1 引物的設計 根據(jù)GenBank 中豬肺炎支原體16s RNA 基因設計一對通用引物，用于豬肺炎支原體的擴增，由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：上游引物P1：5'-ACGCGTCGACAGAGTTTG ATCCTG-3'，下游引物P2：5'-CGCGGATCCGCTA CCTTGTTACGA-3'，預計擴增目的片段1 600 bp。

1.3.2 模板制備 取適量典型的支原體肺炎的肺組織，碾磨，取1 μL 上清液作為模板。

1.3.3 PCR 檢測 PCR 體系為50 μL：2×T5 Direct PCR Mix 25 μL，10 μmol/L P1、P2 各1 μL，模板1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 擴增程序為98 ℃3 min，然后35 個循環(huán)：98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃10 s；最后72 ℃5 min；取10 μL 擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 PCR 產(chǎn)物的序列分析 將陽性PCR 產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，序列用Blast 軟件進行比對分析。

1.3.5 特異性試驗 將本實驗室分離鑒定的豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)，按1.3.3 進行PCR 擴增，電泳觀察結(jié)果。

1.3.6 敏感性試驗 測定DNA 濃度，用無菌去離子水按10 倍濃度梯度分別稀釋調(diào)整至100～0.001 μg/μL，分別進行擴增。

1.4 PCR 鑒定方法的應用

2017 年1 月至2018 年12 月從河南省及周邊省份豬場發(fā)生呼吸困難豬的實變肺臟共采集348份，用建立的PCR 方法進行鑒定。

2 試驗結(jié)果

2.1 豬肺炎支原體PCR 方法的建立

2.1.1 PCR 鑒定 將疑似豬肺炎支原體的肺組織提取DNA，進行擴增，結(jié)果如圖1 擴增出預期大小符合的片段。陽性片段回收，連接T 載體，測序，比對，序列與168 株同源性均在95%以上。

圖1 豬肺炎支原體組織PCR 擴增結(jié)果

2.1.2 特異性試驗 用PCR 方法對豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌進行擴增，結(jié)果均未擴增出片段（圖2），證明本PCR 方法有較好的特異性。

圖2 PCR 特異性試驗結(jié)果

2.1.3 敏感性試驗 敏感性試驗結(jié)果顯示，其PCR檢測的靈敏度可達0.1 μg/μL DNA（圖3）。對0.01 μg/μL 和0.001 μg/μL 均無擴增，說明該體系擴增下限濃度為0.1 μg/μL。

圖3 PCR 敏感性試驗

2.2 PCR 方法的應用結(jié)果

2017 年1 月至2018 年12 月從河南省豬場發(fā)生呼吸困難豬的實變肺臟共采集348 份，用建立的PCR 方法鑒定出豬肺炎支原體226 份陽性，陽性率為64.94%。

3 討論

豬肺炎支原體可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡、品種、性別的豬都易感染，該病一年四季都可發(fā)生。病豬和隱性帶毒豬是主要傳染源，無臨診癥狀有病理變化豬，或無臨診癥狀無病理變化陰性帶菌豬較常見。豬肺炎支原體的診斷方法主要有病原的分離和鑒定，ELISA 方法檢測抗體、PCR、原位雜交、芯片檢測等。PCR 方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學診斷中較為普遍的一種方法。病原的分離鑒定是檢測病原最為準確、有效的方法，但也是最復雜、最難、最費時間的方法[3-12]。

而常規(guī)的PCR 檢測操作中，對病變肺組織進行研磨后，豬肺炎支原體的含量極少，因此PCR 方法容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，普通PCR 檢測方法使用的Taq 酶對極微量的DNA 檢出極其困難，極易造成假陰性結(jié)果，而本試驗中使用的T5 PolStar DNA Polymerase 專為動物組織的直接PCR 擴增而設計，樣品可以直接作為模板而無需提取DNA，為針對動物來源模板優(yōu)化的高保真DNA 聚合酶，具有快速擴增及耐受抑制物的能力，是在具有校正活性的高保真DNA 聚合酶基礎上改造而來，融合特殊的DNABinding 結(jié)構(gòu)，使其具有超快的延伸速度，保真度比普通的Taq DNA 聚合酶高20 倍，PCR Mix 中含特異性增強因子SuperPrime 及延伸增強因子Extension Enhancer，可在模板質(zhì)量不佳或低濃度情況下仍可擴增成功，配合優(yōu)化的反應緩沖液極大地減少擴增條件的探索，大幅縮短了操作時間，整個過程30 min 內(nèi)完成。

本研究建立了豬肺炎支原體的快速直接PCR方法，該方法快速敏感準確，陽性率達64%以上，表明豬肺炎支原體在患呼吸道疾病的豬群中感染率較高，是危害豬場的較為普遍、嚴重的病原。對河南省豬肺炎支原體的病原流行病學研究、疫苗研究、綜合防制提供參考。