蔡方舟，陳 倩，佟 巍，李 丹，王 衛(wèi)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

狂犬病是一種由狂犬病毒(rabies virus, RV)感染引起的急性傳染病，是迄今為止唯一病死率高達(dá)100%的烈性傳染病[1-2]。我國是世界第二大狂犬病高發(fā)國，僅次于印度；1949年至2015年，我國大陸報(bào)告狂犬病130494例，平均每年1977例[3]。近年來，在全社會的重視和努力下，我國狂犬病病例持續(xù)下降，但發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)在法定傳染病報(bào)告里依然排列前茅，不可忽視[4]?？袢】煞啦豢芍?，合格的疫苗可用于狂犬病毒暴露前或暴露后預(yù)防；一旦發(fā)病，則無有效的治療方法或策略。因此，完善狂犬病動物模型，檢定狂犬病疫苗效價(jià)，探索狂犬病發(fā)病機(jī)制，對于狂犬病的防治均具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。實(shí)驗(yàn)小鼠具有遺傳背景均一、實(shí)驗(yàn)操作簡便、實(shí)驗(yàn)試劑完善等優(yōu)點(diǎn)，常用于狂犬病的發(fā)病機(jī)制研究及預(yù)防疫苗的評價(jià)[3]。

為了解狂犬病毒及疫苗對實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫效果，常需要檢測小鼠血清中抗狂犬病毒抗體水平。常用的檢測方法包括世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)，以及世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)，可定量檢測動物或人體內(nèi)狂犬病中和抗體水平；但缺少規(guī)范的結(jié)合抗體檢測方法。基于此，為完善狂犬病小鼠模型技術(shù)體系，本研究建立了一種基于間接ELISA法檢測小鼠血清中抗狂犬病毒IgG抗體的方法，可用于狂犬病小鼠模型的分析以及疫苗效價(jià)的評估。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級KM小鼠(雌性，體重12～14 g，3～4周齡)，由北京華阜康生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司提供[SCXK (京)2014-0004]，用于狂犬病毒陽性血清和陰性血清的制備。動物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所生物安全二級動物實(shí)驗(yàn)室(ABSL-2)，遵照3R原則進(jìn)行。動物實(shí)驗(yàn)方案得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：WW18003)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

狂犬病毒陽性血清和陰性血清由本課題組自行制備，具體方法詳見1.3.1。用于特異性實(shí)驗(yàn)的小鼠肝炎病毒、小鼠呼腸孤病毒III型、小鼠細(xì)小病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠腺病毒、小鼠仙臺病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的陽性血清來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所檢測中心，免疫熒光法(IFA)確認(rèn)陽性，抗體效價(jià)均不低于1∶320。

1.2 主要試劑與儀器

狂犬病疫苗國家標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院，批號為250009-201108，效價(jià)為6.61 U/mL?？袢《究乖A(yù)包被微孔板(96微孔板)、TMB顯色液、終止液(稀硫酸)、PBST洗液等購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司(批號：20180906)。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(貨號：ZB-2305WW)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，抗體濃度為400 μg/mL。PBS(貨號：SH30256.01)購自HyClone公司。酶標(biāo)儀(型號：FLUOStar Omega)由德國BMG Labtech公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠陽性血清及陰性血清的制備

狂犬疫苗國家標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋成1∶125，每只小鼠腹腔注射0.5 mL，0 d、7 d免疫，共免疫2次。分離免疫后14 d小鼠血清，進(jìn)行抗狂犬病毒中和抗體效價(jià)快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)測定。根據(jù)WHO指導(dǎo)原則，RFFIT結(jié)果大于0.5 IU/mL的樣品確定為陽性血清。陽性血清混合后，使用BSA方法測定其濃度為64.5 mg/mL。陰性血清來自未免疫小鼠，RFFIT實(shí)驗(yàn)確認(rèn)對狂犬病毒沒有中和效果。

1.3.2 ELISA方法的基本流程

狂犬病毒抗原包被由北京世紀(jì)元亨公司具體操作，其簡單流程如下：96孔板使用純化的狂犬病毒進(jìn)行包被，包被時(shí)將包被液(0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液，0.05 mol/L堿)稀釋后加入微孔板中，每孔加100 μL，4℃孵育24 h，甩干；加入封閉液(0.12% Tris緩沖液，含蛋白)，每孔家200 μL，4℃孵育24 h，甩干。對包被板做干燥、密封等處理，保存于4℃冰箱。獲得狂犬病毒抗原包被板之后，向其中加入PBS稀釋的血清標(biāo)本，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；PBST洗板5次，加入PBS稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；PBST洗板5次，加入顯色底物A(0.05 mol/L pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，含H2O2)及顯色底物B(0.01 mol/L pH 5.0檸檬酸緩沖液，含EDTA-Na2、四甲基聯(lián)苯胺TMB)，37℃顯色15 min；加入終止液(0.5 mol/L H2SO4)，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的OD值。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為確定樣品的最佳稀釋度及二抗的最佳濃度，根據(jù)文獻(xiàn)[5]，使用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化ELISA實(shí)驗(yàn)條件。樣品使用PBS進(jìn)行系列稀釋，根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，稀釋成4個稀釋度，分別為1:50～1∶400；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體也使用PBS進(jìn)行系列稀釋，根據(jù)抗體說明書，稀釋為5個濃度，稀釋度為1∶2500～1:40 000，濃度分別為160 ng/mL、80 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL，詳見表1。

1.3.4 方法特異性測試

使用該ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠常見病毒的陽性血清，包括小鼠肝炎病毒、小鼠呼腸孤病毒III型、小鼠細(xì)小病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠腺病毒、小鼠仙臺病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的陽性血清，以及小鼠陰性血清；判斷其結(jié)果是否為陰性，從而確定該方法的特異性。

1.3.5 方法敏感性測試

使用PBS系列稀釋陽性血清，稀釋度分別為1:10、1:50、1∶100、1∶500、1∶1000、1∶5000、1:10 000、1:50 000、1∶100 000、1∶500 000、1∶1 000 000，濃度分別為6.45 mg/mL、1.29 mg/mL、645 μg/mL、129 μg/mL、64.5 μg/mL、12.9 μg/mL、6.45 μg/mL、1.29 μg/mL、645 ng/mL、129 ng/mL、64.5 ng/mL。用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測，確定其能檢測出陽性結(jié)果的最低樣品濃度，從而確定該方法的敏感性。

1.3.6 方法重復(fù)性測試

選擇本課題組制備的陽性血清樣本各3份，經(jīng)3次重復(fù)檢測，每次同一樣本設(shè)3個復(fù)孔，確定檢測符合率，并計(jì)算變異系數(shù)(CV=(SD÷MN)×100%)[7]，從而確定該方法的重復(fù)性。

1.3.7 符合率檢驗(yàn)

將本文建立的間接ELISA方法與美國Alpha Diagnostic International公司的間接法試劑盒Mouse Anti-Rabies IgG ELISA(貨號：600-030-MRG)比較，分析兩種方法檢測結(jié)果的一致性及符合率。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA法工作條件的確定

為建立該ELISA方法，使用正交實(shí)驗(yàn)方法(表1)，確定檢測樣品的最佳稀釋度和二抗最佳工作濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨著樣品稀釋度的提高，OD值逐漸降低；隨著二抗?jié)舛鹊慕档?，OD值逐漸降低，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。按照陽性樣品OD450值>1.0，陰性結(jié)果OD450值<0.1，P/N值最大的實(shí)驗(yàn)組合為最佳組合的標(biāo)準(zhǔn)[8]，我們發(fā)現(xiàn)該ELISA的樣品最佳稀釋度是1∶100，二抗最佳濃度為40 ng/mL，結(jié)果見表2；后續(xù)均使用該工作濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 臨界值(cut-off值)的確定

2.3 方法特異性

為了解該方法是否特異，用所建立的間接ELISA方法檢測小鼠肝炎、小鼠呼腸孤病毒III型、小鼠細(xì)小病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠腺病毒、小鼠仙臺病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒等小鼠常見病毒的陽性血清，結(jié)果均為陰性，見表3，說明該ELISA方法與上述病毒抗體無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

表1 正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 不同稀釋倍數(shù)血清與不同濃度二抗反應(yīng)的OD450值

圖1 陰性血清間接ELISA檢測結(jié)果

2.4 方法敏感性

為了解該方法的檢測靈敏度，本研究還進(jìn)行了敏感性實(shí)驗(yàn)。將本科室制備的濃度為64.5 mg/mL的陽性樣品進(jìn)行稀釋(1:10、1:50、1∶100、1∶500、1∶1000、1∶5000、1:10 000、1:50 000、1∶100 000、1∶500 000、1∶1 000 000)，濃度分別為6.45 mg/mL、1.29 mg/mL、645 μg/mL、129 μg/mL、64.5 μg/mL、12.9 μg/mL、6.45 μg/mL、1.29 μg/mL、645 ng/mL、129 ng/mL、64.5 ng/mL，用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測。經(jīng)3次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)樣品稀釋度在1∶500時(shí)仍能檢測出陽性(見圖2)，說明該方法的最低檢測靈敏度為129 μg/mL。

表3 方法特異性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

圖2 方法敏感性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

表4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table4Results of reproducibility test

樣品Samples1st2nd3rd x±sCV% x±sCV% x±sCV%10.572±0.1263.60.456±0.0449.70.430±0.0597.621.216±0.1088.91.115±0.0827.31.034±0.0615.930.903±0.1701.50.769±0.0816.10.657±0.0253.8

2.5 可重復(fù)性

為了解本研究建立方法的可重復(fù)性，選擇本科室制備的陽性血清樣本各3份，經(jīng)3次檢測，每次同一樣本設(shè)3個復(fù)孔，確定檢測符合率，并計(jì)算變異系數(shù)(CV%)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3份陽性血清樣本經(jīng)重復(fù)檢測，診斷符合率為100%，變異系數(shù)為1.5%～9.7%，小于10%，見表4；說明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 符合率檢驗(yàn)

將本文建立的間接ELISA方法與商品化的試劑盒進(jìn)行比較，分別檢測18個樣品，本文建立的方法和商品化試劑盒均檢出10例陽性，陽性率為55.56%，與樣品實(shí)際情況相符，兩者總符合率為100%。

3 討論

為研究狂犬病毒的感染及致病機(jī)制，評價(jià)狂犬疫苗及藥物的效果，動物模型是非常重要的研究工具。狂犬病毒幾乎可以感染所有的溫血脊椎動物，包括許多野生動物和常用的實(shí)驗(yàn)動物，如犬、倉鼠、小鼠、豚鼠、大鼠和家兔等(其敏感性遞減)。實(shí)驗(yàn)研究和病毒分離時(shí)較常應(yīng)用幼齡小鼠和倉鼠，因其敏感性高，潛伏期短且恒定(5～7 d)。家兔在感染后，規(guī)律地顯現(xiàn)麻痹癥狀。給1日齡雛雞腦內(nèi)接種狂犬病毒，可以使其發(fā)生致死性麻痹(初代街毒的潛伏期可能長達(dá)1個月左右)，連續(xù)傳代后的潛伏期縮短至6 d。地鼠也常被用于狂犬病暴露后疫苗免疫動物模型[9]。鑒于實(shí)驗(yàn)小鼠的諸多優(yōu)點(diǎn)，小鼠模型被廣泛應(yīng)用于狂犬病感染及發(fā)病機(jī)制研究，以及狂犬病疫苗體內(nèi)評價(jià)等工作中[10]。

了解狂犬病毒或疫苗對小鼠的免疫效果，進(jìn)行狂犬病小鼠模型分析，抗體水平檢測是非常關(guān)鍵的一環(huán)。目前，檢測狂犬病抗體的有很多種，如熒光抗體中和實(shí)驗(yàn)(FAVN)、小鼠中和實(shí)驗(yàn)(MNT)、快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)等[11-13]，但是這些實(shí)驗(yàn)都存在著相應(yīng)的缺點(diǎn)，如儀器需求較高、成本較高、試驗(yàn)周期較長等；還需要使用狂犬病毒活毒，存在實(shí)驗(yàn)室生物安全風(fēng)險(xiǎn)。為完善狂犬病小鼠模型技術(shù)體系，了解結(jié)合抗體在小鼠體內(nèi)的變化規(guī)律，急需建立一種簡便易行的抗體檢測方法。國際上只有少數(shù)公司能生產(chǎn)類似試劑盒，但也存在貨期長、成本高等問題。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)只需要較短的時(shí)間(2～3 h)以及較低的成本，在定性分析上ELISA具有較大優(yōu)勢。而且，ELISA與其他抗體檢測技術(shù)具有非常高的符合率。如ELISA和FAVN檢測狂犬病疫苗免疫犬血清抗體的陽性符合率為100%[14]。RFFIT、FAVN及RVNA Kit等三種方法可通用于人血清中抗狂犬病毒中和抗體的檢測，而ELISA檢測結(jié)果與中和抗體效價(jià)有一定差距，但在經(jīng)過優(yōu)化、校驗(yàn)后ELISA也可以在有效范圍內(nèi)用于狂犬病抗體的檢測[15-16]。為此，作者嘗試建立一種基于間接ELISA法檢測小鼠血清中抗狂犬病毒IgG抗體的方法，可用于狂犬病小鼠模型的分析以及疫苗效價(jià)的評估。

本研究建立的小鼠抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測方法具有良好的可重復(fù)性，且特異性良好，與小鼠常見病毒無交叉反應(yīng)，能在抗體濃度大于129 μg/mL時(shí)檢測出陽性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)以商品化的試劑盒作為對照進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者符合率很高，符合率達(dá)到100%，證明自研試劑盒性能良好，可應(yīng)用于狂犬病小鼠模型的抗體動力學(xué)追蹤分析。綜上所述，本文所建立的間接ELISA方法適于狂犬病小鼠模型的分析以及疫苗臨床前的檢測。