控制水稻中胚軸伸長的QTL 定位

牛世朋 呂育松 鄔亞文 魏祥進(jìn) 圣忠華 焦桂愛 胡時開 唐紹清

（中國水稻研究所，杭州310006；*通訊作者：sqtang@126.com）

胚軸是構(gòu)成幼苗形成過程以及植株生長過程中比較重要的部分。在水稻中，中胚軸的伸長能夠?yàn)榉N子萌發(fā)破土出苗提供動力，提升水稻出苗率。中胚軸的長度在野生稻和栽培稻中的多樣性呈現(xiàn)明顯差異，具有優(yōu)良的中胚軸伸長能力的種質(zhì)將能推動水稻從傳統(tǒng)的播種、移秧的耕種方式向節(jié)約勞動力和水資源的直播耕種方式的轉(zhuǎn)變。長中胚軸品種一般具有較強(qiáng)的破土能力，這樣的品種能夠在深覆土的情況下保持較高的出芽率[1-2]，有利于水稻直播，大大節(jié)省了水稻種植的勞動成本。與傳統(tǒng)的栽種方式相比，直播稻栽培主要有以下四個優(yōu)點(diǎn)：一是省去了準(zhǔn)備秧田、育秧和插秧的過程，節(jié)約了人力物力，降低了水稻的栽種成本；二是省去了拔秧后插秧的返青過程，縮短了生育期；三是增加了單位面積分蘗，從而大大提高了水稻產(chǎn)量；四是方便進(jìn)行種植和收獲，有利于大規(guī)模種植[3]。因此，揭示控制中胚軸伸長的機(jī)制可以推動水稻種植向高效、節(jié)約型耕種模式轉(zhuǎn)變。

在目前使用的水稻品種和種質(zhì)資源中，具有長中胚軸特性的材料較少。水稻遺傳特性在控制中胚軸伸長中起著決定性作用。林建榮等[4]對水稻中胚軸伸長特性進(jìn)行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)中胚軸伸長特性受兩對隱性基因控制。雜草稻中的部分品種有較長的中胚軸是一直以來容易被忽略的重要種質(zhì)資源。雜草稻具有較強(qiáng)的中胚軸伸長能力，充分利用雜草稻中胚軸長的性狀對我國的直播稻育種有較大幫助[5]。

關(guān)于長中胚軸伸長QTL 的研究已有部分報(bào)道。林建榮等[4]研究表明，中胚軸伸長特性受2 對隱性基因控制，并與株高存在一定的連鎖關(guān)系。曹立勇等[6]利用秈稻IR64 和粳稻Azuccena 產(chǎn)生的DH 群體在第1、3、6、7、8、12 號染色體上共檢測到8 個控制中胚軸伸長的QTL。黃成等[1]利用沈農(nóng)265 和麗江新團(tuán)黑谷的RIL 群體為材料在水和赤霉素兩種條件下在第1、2、3、6、11號染色體上檢測到5 個QTL。LU 等[7]利用1 個469 個秈稻材料組成的群體進(jìn)行SNP 標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共檢測到17 個位點(diǎn)與中胚軸伸長有關(guān)。WU 等[8]通過核心種質(zhì)資源和抗旱材料在黑暗條件下培養(yǎng)，共檢測到6 個中胚軸伸長的QTL 位點(diǎn)，并且與前人已定位的QTL 位置吻合，證明了位點(diǎn)的存在。目前已經(jīng)定位到44 個控制中胚軸伸長的QTL 位點(diǎn)，但至今還未克隆出控制中胚軸伸長的主效基因。

影響中胚軸伸長的因素有很多，包括自身因素和外界因素兩大類。馬殿榮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，中胚軸長度與種子內(nèi)源α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、可溶性糖含量相關(guān)。雜草稻發(fā)芽初期淀粉酶活性強(qiáng)，可溶性糖含量高，為中胚軸伸長提供物質(zhì)能量，導(dǎo)致雜草稻中胚軸明顯長于野生稻。除了內(nèi)部環(huán)境外，外界環(huán)境對中胚軸的伸長也有很大影響。在所有外界調(diào)控中胚軸伸長的因子中，光照影響中胚軸伸長效果最顯著。杜金友等[10]研究發(fā)現(xiàn)，光對中胚軸的長度有明顯的抑制作用，是明顯的光調(diào)控途徑。王瑩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，雜草稻和栽培稻的中胚軸在光照環(huán)境下均不伸長，證明了光照對中胚軸的伸長有抑制作用。激素調(diào)控途徑在中胚軸伸長中也起著重要作用。XIONG 等[12]在日本晴突變體中發(fā)現(xiàn)了長中胚軸的突變體gy1，GY1基因通過結(jié)合OsEIL2，調(diào)控MHZ7/OsEIN2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游，進(jìn)而抑制茉莉酸的生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)中胚軸伸長。另外，外界環(huán)境會與內(nèi)源物質(zhì)協(xié)同調(diào)控中胚軸的伸長，比如光和油菜素類固醇調(diào)控水稻光形態(tài)發(fā)生從而調(diào)控中胚軸伸長[13]。

表1 Asominori 和IR24 群體檢測到控制中胚軸伸長QTL

本研究以Asominori 和IR24 重組自交系（RIL）對水稻控制中胚軸伸長性狀進(jìn)行QTL 定位分析，利用Asominori 為遺傳背景、秈稻IR 24 為染色體片段供體的片段代換系群體（CSSLs）驗(yàn)證得到的QTL 位點(diǎn)，并與前人的QTL 定位結(jié)果進(jìn)行了比較，旨在為長中胚軸和強(qiáng)頂土能力品種的選育及其分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種提供一些信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Asominori/IR24 重組自交系群體（RIL），由172 個家系組成[14]；Asominori 為背景的IR24 全基因組片段置換系群體（CSSLs）包含64 個家系，由12 條染色體上的116 個RFLP 多態(tài)性分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇[15]。兩套群體以及分子數(shù)據(jù)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)萬建民老師課題組提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)方法參考陳冰孀培養(yǎng)玉米中胚軸方法，并適當(dāng)修改[16]。

1.2.1 浸種、催芽

每個家系挑選30 粒飽滿的種子放在浸種袋中，30℃條件下浸種24 h；取出，用濕毛巾包好，然后30℃條件下催芽24 h，催芽過程中保持毛巾濕潤。

1.2.2 固體培養(yǎng)基制備

稱取8 g 瓊脂放在1L 雙蒸水（ddH2O）中，混勻；滅菌鍋中121℃滅菌15 min；滅菌完成后冷卻到60℃，混勻，均勻倒入8 cm×15 cm 廣口瓶中，150 mL/瓶。

1.2.3 播種

挑選20 粒處理好的出芽一致的種子，均勻擺放在固體培養(yǎng)基上。

1.2.4 培養(yǎng)

置于人工氣候室內(nèi)黑暗培養(yǎng)，溫度30℃，濕度75%RH。

1.2.5 測量

人工氣候室培養(yǎng)7 d，用毫米刻度尺測量各家系的中胚軸長度，并做好記錄。去掉偏差較大的數(shù)據(jù)，選取中胚軸長度集中的10 株然后取平均值作為每個家系中胚軸長度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用WinQTLCart 軟件[17]對RIL 表型值進(jìn)行中胚軸伸長QTL 的顯著性和定位分析。將參數(shù)設(shè)置為自動，選擇前景控制因子方法，設(shè)置排列組合次數(shù)為1 000 次來確定LOD 閾值。當(dāng)實(shí)際求得LOD 大于閾值時，就認(rèn)為該區(qū)段存在1 個QTL。將LOD 值2.0 作為判斷QTL 存在的閾值，并分析其貢獻(xiàn)率、加性效應(yīng)以及效應(yīng)來源。遵照McCouch 原則[18]進(jìn)行QTL 命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和重組自交系中胚軸的表型

人工氣候室黑暗培養(yǎng)7 d 后，親本和RIL 群體的生長情況出現(xiàn)明顯差異。親本Asominori 中胚軸長度比較短，僅為0.2 cm；IR24 中胚軸長度較長，達(dá)到了0.6 cm（圖1a）。在RIL 群體中，中胚軸長度差異比較大，長度從0 cm 到3.5 cm 不等（圖1b）。

2.2 水稻中胚軸的QTL 分析

運(yùn)用WinQTLCart 軟件共監(jiān)測到3 個QTL 位點(diǎn)，分別位于第2、第3 和第7 號染色體上，分別命名為qML2、qML3、qML7，其 對 應(yīng) 的 標(biāo) 記 區(qū) 間 為RM425 ～RM138、RM7097 ～RM3816 和RM214 ～RM560，LOD 值分別為2.34、3.48 和3.41，貢獻(xiàn)率分別為7.25、11.07、8.86。前2 個位點(diǎn)來自于IR24，第3 個來自于Asominori（表1）。

2.3 利用片段代換系驗(yàn)證QTL 位點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)檢測到的3 個位點(diǎn)中，qML2和qML7在Asominori 為背景的IR24 片段置換的片段代換系群體中有對應(yīng)的代換家系，qML3沒有對應(yīng)的代換家系。因此利用Asominori 為背景的IR24 片段置換的片段代換系對qML2和qML7進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 代換家系CSSL12 和CSSL13 代換情況及中胚軸表型

表3 代換家系CSSL37 代換情況及中胚軸表型

圖1 親本及RIL 群體中胚軸表型

圖2 Asominori、代換系CSSL12 和CSSL13 中胚軸表型

圖3 Asominori、CSSL12 和CSSL13 中胚軸表型，標(biāo)尺：1 cm

2.3.1qML2位點(diǎn)代換系進(jìn)行驗(yàn)證

在qML2位點(diǎn)，有2 個獨(dú)立的代換家系CSSL12 和CSSL13 發(fā)生了代換（代換情況如表2 陰影部分）。利用2 個獨(dú)立的代換系驗(yàn)證qML2位點(diǎn)：與親本Asominori相比，CSSL12 代換系中胚軸極顯著伸長（圖2a），CSSL13 中胚軸伸長不顯著（圖2b），說明在RM6～RM425 之間存在控制中胚軸伸長的QTL 位點(diǎn)。

圖4 qML3 和qML7 位點(diǎn)與前人研究比較

2.3.2qML7位點(diǎn)代換系進(jìn)行驗(yàn)證

在qML7位點(diǎn)，CSSL37 發(fā)生代換（代換情況如表3 陰影部分）。利用CSSL37 去驗(yàn)證qML7位點(diǎn)的存在：與親本Asominori 相比，CSSL37 中胚軸伸長受到抑制（圖3），中胚軸極顯著縮短（表3），說明在RM214～RM346 之間存在控制中胚軸伸長的QTL 位點(diǎn)。

2.4 控制中胚軸伸長QTL 位點(diǎn)與前人研究進(jìn)行比較

與前人的研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，qML3在不同群體的重復(fù)性很好，本研究中定位到的qML3位點(diǎn)與黃成[1]、曹立勇[6]和Redoa[19]位點(diǎn)基本重合（圖4 a），說明qML3是一個比較穩(wěn)定的位點(diǎn)，在不同群體中可以重復(fù)檢測到，可以作為一個目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行下一步的基因克隆。qML7位點(diǎn)與曹立勇等的結(jié)果基本一致[6]（圖4b），說明了qML7的存在。在先前的研究中，qML2位點(diǎn)未被檢測到，利用片段置換系驗(yàn)證qML2位點(diǎn)，qML2位點(diǎn)的片段代換（CSSL12）導(dǎo)致中胚軸極顯著伸長證明了qML2的存在，可作為一個新位點(diǎn)進(jìn)行下一步的基因克隆。

2.5 水稻中胚軸伸長與株高之間的關(guān)系

為了驗(yàn)證株高與中胚軸長度之間的關(guān)系，考察了2018年杭州大田重組自交系各家系的株高，運(yùn)用Win－QTLCart 軟件進(jìn)行控制株高QTL 定位。共監(jiān)測到2 個QTL 位點(diǎn)，位于第2、第7 號染色體上，分別命名為qPH2和qPH7，對應(yīng)的標(biāo)記區(qū)間為RM71～RM5390 和RM82～RM180（表4）。由控制株高QTL 定位結(jié)果可以看出，控制中胚軸伸長位點(diǎn)（圖5 黑色部分）與控制株高位點(diǎn)（圖5 淺灰色部分）未發(fā)生重合，表明在Asominori 和IR24 群體中控制中胚軸伸長性狀和控制株高性狀具有不同的遺傳基礎(chǔ)，這將有利于我們在育種中選育長中胚軸且株高適宜的品種。

表4 Asominori 和IR24 群體檢測到控制株高QTL

圖5 Asominori 和IR24 群體檢測到控制中胚軸伸長和控制株高QTL

圖6 Asominori 和CSSL12 出土情況（a 為3 d 出土情況；b 為

圖7 Asominori 和CSSL12 出芽率

2.6 中胚軸伸長對破土能力的影響

代換系表型考察發(fā)現(xiàn)，與親本Asominori 相比代換家系CSSL12 中胚軸極顯著伸長（圖2a）。選用Asominori 和CSSL12 家系進(jìn)行破土實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)中胚軸對破土能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Asominori 相比，代換系CSSL12 出苗更迅速，出苗率更高、苗長勢更均勻（圖6、圖7），說明CSSL12 中片段的代換促進(jìn)了中胚軸的伸長，進(jìn)而提升了水稻的破土能力。淺層土覆蓋時水稻出苗主要由中胚軸伸長提供動力，本研究與預(yù)期結(jié)果符合。我們可以通過分子標(biāo)記輔助方法將控制中胚軸伸長QTL 進(jìn)行聚合，再結(jié)合農(nóng)藝性狀篩選，培養(yǎng)適合直播的優(yōu)良水稻品種。

3 討論

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球一半以上的人口以稻米為主食。但在實(shí)際種植過程中，水稻的育秧、取秧、插秧等工作耗費(fèi)了大量的人力物力，因此水稻直播栽培也漸漸受到重視。水稻直播出苗率與水稻秧苗中胚軸及胚芽鞘的長度有極大的關(guān)聯(lián)[20]。因此，對水稻中胚軸及胚芽鞘伸長機(jī)制的研究有極其重要的意義。不同水稻品種中胚軸伸長能力存在差異，既受遺傳因素的影響，也極容易受外界環(huán)境的影響。影響中胚軸伸長的外界因素主要包括水分、溫度、CO2濃度、光照等，以往中胚軸實(shí)驗(yàn)是用濾紙放在培養(yǎng)皿里面進(jìn)行培養(yǎng)，而本實(shí)驗(yàn)也革新了先前的培養(yǎng)方式，采用適度硬度的瓊脂培養(yǎng)基（0.8%）進(jìn)行培養(yǎng)，這樣更容易控制培養(yǎng)的濕度，排除水分的變化對中胚軸伸長的影響。

水稻中胚軸長度受到基因型與環(huán)境共同作用，不同品種之間差異較大且可以穩(wěn)定遺傳，但也因外界環(huán)境的變化而產(chǎn)生很大差異[21]。曹立勇等利用秈粳交IR64/Azucena 的DH 群體進(jìn)行了控制中胚軸伸長的QTL 定位，檢測到的qml3（與本實(shí)驗(yàn)qML3位點(diǎn)重合）效應(yīng)來源于中胚軸長的親本IR64，檢測到的qml7-1（與本實(shí)驗(yàn)qML7位點(diǎn)重合）效應(yīng)來源于短中胚軸親本Azucena，與本實(shí)驗(yàn)檢測到的qML3和qML7效應(yīng)來源一致，說明在不同的群體中qML3 和qML7有相同的效應(yīng)來源。另外，qML2與先前的控制中胚軸伸長的位點(diǎn)未發(fā)生重合，且qML2加性效應(yīng)來源于長中胚軸親本IR24，在qML2位點(diǎn)的片段代換系驗(yàn)證中，與親本Asominori 相比，qML2對應(yīng)的代換家系CSSL12 中胚軸明顯伸長，說明IR24 的qML2位點(diǎn)片段的代換導(dǎo)致中胚軸極顯著伸長。

已有研究發(fā)現(xiàn)，影響水稻中胚軸的基因與控制株高以及控制節(jié)間長度的基因可能具有某種關(guān)聯(lián)，這給育種工作帶來了一定的困擾[4]。由于株高和節(jié)間長度關(guān)系到水稻抗倒伏能力的強(qiáng)弱，株高越高、節(jié)間長度越長，抗倒伏能力越弱，而株高越矮、節(jié)間長度越短的材料一般中胚軸會越短。因此在直播稻育種過程中，選育中胚軸長的材料往往會導(dǎo)致選育品種株高過高而不適合水稻直播。我們利用Asominori 和IR24 重組自交系群體進(jìn)行株高和中胚軸伸長的QTL 定位時發(fā)現(xiàn)，控制株高和控制中胚軸伸長的基因座未發(fā)生重合，說明2個性狀有不一樣的遺傳基礎(chǔ)，這也為選育長中胚軸表型但株高合理的材料提供了可能。