張艷芳，謝芝勛，鄧顯文，謝志勤，張民秀，羅思思，謝麗基，范 晴，曾婷婷，黃嬌玲，劉加波

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

禽腎炎病毒（avian nephritis virus，ANV）是引起雞腸道疾病的重要病原體之一，感染各齡期的雞，但以侵害雛雞為主，也可感染火雞、鴨子和鴿子[1]。該病毒主要引起一種典型的亞臨診癥狀，雖致病力不強(qiáng)，但感染性強(qiáng)，能在雞群中迅速傳播，廣泛見于世界各地，嚴(yán)重的可導(dǎo)致腸炎、腎損傷及腎功能衰竭等，并與雞矮小綜合征有關(guān)[2-3]。雞細(xì)小病毒（chicken parvovirus，ChPV）同屬雞腸道病毒，主要侵害雛雞，可引起以腹瀉、精神抑郁、體溫調(diào)節(jié)障礙、生長(zhǎng)遲緩、營(yíng)養(yǎng)吸收障礙等為特征的急性或慢性腸道性疾病，與矮小綜合癥和營(yíng)養(yǎng)不良綜合癥有關(guān)，在雞群中普遍存在，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。ANV 與ChPV 均可引起雛雞營(yíng)養(yǎng)吸收障礙，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良及矮小綜合癥的發(fā)生，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，特別是混合感染時(shí)，危害程度尤為明顯。多重PCR 可同時(shí)檢測(cè)和鑒別多種病原體，不僅靈敏度高、檢測(cè)快速、特異性好，且操作簡(jiǎn)易、能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[7]，在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8-9]。本研究設(shè)計(jì)了2對(duì)ANV 和ChPV 擴(kuò)增片段大小分別為511 bp和242 bp 的特異性引物，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒的雙重PCR 檢測(cè)方法。

1 材料

1.1 主要病原體

禽腎炎病毒（ANV）、雞細(xì)小病毒（ChPV）、禽流感病毒H9亞型（AIV-H9）、雞傳染性喉氣管炎病毒（AILTV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、馬立克病毒（MDV）和大腸桿菌（E.coli），由本實(shí)驗(yàn)室保存（表1）。

1.2 主要試劑

DNA/RNA 提取試劑盒、細(xì)菌DNA 抽提試劑盒、膠回收試劑盒、2×TaqPCR Mix 均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑、pMD 18T Vector、100 bp Marker Ladder 購(gòu)自大連寶生物公司。

表1 毒株來源

1.3 主要儀器

移液槍，購(gòu)自法國(guó)吉爾森公司；生物安全柜，購(gòu)自美國(guó)Baker 公司；PCR 擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；NanDrop ND-2000微量核酸檢測(cè)儀，購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；高速離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司；電泳儀，購(gòu)自北京六一儀器公司等。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中ANV 的ORF基因和ChPV的NS1基因的保守序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物和DNAStar 軟件進(jìn)行比對(duì)篩選，通過NCBI的Blast 驗(yàn)證，設(shè)計(jì)篩選出了兩對(duì)ANV 和ChPV特異性引物（表2）。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表2 兩對(duì)特異性引物序列

2.2 DNA/RNA 抽提及反轉(zhuǎn)錄

參照DNA/RNA 提取試劑盒說明書，提取ChPV、MDV 和AILTV 的DNA；抽 提ANV、AIV-H9、IBV、NDV 和ARV 的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑按說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用細(xì)菌DNA 抽提試劑盒提取E.coliDNA。均保存于-30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

擴(kuò)增體系為25 μL：2×PCR Mix 12.5 μL，ANV 的cDNA 和ChPV 的DNA 各1 μL 作為混合模板，2對(duì)引物不同比例共加入2 μL（濃度均為20 mol/L），最后用ddH2O 補(bǔ)足25 μL 反應(yīng)體系。對(duì)雙重PCR 各引物比例進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳比例，再設(shè)置梯度PCR 選擇最適退火溫度。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，退火溫度50～60 ℃，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延 伸10 min，12℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果，拍照保存。

2.4 特異性試驗(yàn)

利用已優(yōu)化的雙重PCR 方法，對(duì)AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV 和E.coli待 檢核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，檢驗(yàn)所建立方法的特異性。

2.5 敏感性試驗(yàn)

使用NanDrop ND-2000微量核酸檢測(cè)儀，測(cè)定ANV 和ChPV 的核酸模板濃度，對(duì)已知濃度的模板按10倍梯度稀釋后，逐一進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增，以評(píng)估本研究建立的雙重PCR 方法的靈敏性。

2.6 臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)

對(duì)2017年11月至2018年5月廣西南寧地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)采集的40份雞泄殖腔拭子樣品，采集后放入含有雙抗的生理鹽水中，置于用冰袋維持低溫的泡沫箱中密封；當(dāng)日帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行核酸抽提和反轉(zhuǎn)錄；應(yīng)用所建立的雙重PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)兩次；將目的條帶回收、克隆，挑選陽(yáng)性菌送至賽默飛廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。

3 結(jié)果

3.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

通過對(duì)ANV 和ChPV 引物比例、退火溫度和反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳引物組合比例：ANV 上下引物各0.4 μL，ChPV 上下引物各0.6 μL（圖1）；最佳退火溫度為53.8℃；最佳ANV 和ChPV 的雙重PCR 反應(yīng)體系：2×PCR Mix 12.5 μL，ANV 和ChPV 上下引物共2μL，混合模板2μL，加ddH2O 補(bǔ)足25 μL；PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，53.8 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min 延伸，12℃保存（圖2）。ANV 和ChPV 均可以特異地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，ANV 為511 bp，ChPV 為242 bp，沒有出現(xiàn)非特異性條帶。

圖1 雙重PCR 引物優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

圖2 雙重PCR 溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

3.2 特異性試驗(yàn)

利用本研究建立的ANV 和ChPV 雙重PCR方法對(duì)10份待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：ANV擴(kuò)增出511 bp 的特異性條帶，ChPV 擴(kuò)增出242 bp的特異性條帶，AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli均沒有出現(xiàn)特異性條帶（圖3）。

圖3 雙重PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 敏感性試驗(yàn)

用NanDrop ND-2000微量核酸檢測(cè)儀測(cè)得ANV 和ChPV 的核酸濃度分別為55 ng/μL 和58 ng/μL。將已知濃度的核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋，應(yīng)用優(yōu)化的雙重PCR 對(duì)各稀釋梯度的模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，本研究建立的雙重PCR 最低能同時(shí)檢測(cè)到55 fg 的ANV 和58 fg 的ChPV（圖4）。

圖4 雙重PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 臨床樣品檢測(cè)

用建立的雙重PCR 對(duì)實(shí)驗(yàn)室采集的40份雞棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果檢出2份ANV 和ChPV 的混合感染、1份ChPV 陽(yáng)性、5份ANV 陽(yáng)性，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致，并且與單重PCR 檢測(cè)及測(cè)序方法得出的結(jié)果一致，部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果見圖5。擴(kuò)增的目的片段與相應(yīng)序列同源性高達(dá)96%～99%。

圖5 雙重PCR 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

4 討論

雞的腸道類疾病嚴(yán)重危害世界各地養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，給家禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ANV 和ChPV 均屬于腸道性疾病病原，雞的腸炎、生長(zhǎng)障礙以及營(yíng)養(yǎng)不良癥狀都與這兩種病毒有關(guān)[2]。雖然這兩種雞病毒的致病性不強(qiáng)，也沒有相關(guān)大暴發(fā)的記錄，但根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)[11]報(bào)道，在孵化雛雞過程中發(fā)現(xiàn)ANV 和ChPV 能夠垂直傳播，并引起孵化率的下降。因此對(duì)這兩種疾病的監(jiān)測(cè)不容忽視。ANV 和ChPV 引起的臨床癥狀較為相似，主要侵害雛雞，在臨床上容易導(dǎo)致混合感染，給臨床診斷帶來困難。目前對(duì)兩種病毒尚沒有進(jìn)行有效的防控，嚴(yán)重地制約了現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。

傳統(tǒng)病毒鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)，常規(guī)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感性也不高，無法實(shí)現(xiàn)快速診斷。PCR 方法作為實(shí)驗(yàn)室常見的實(shí)用型分子生物學(xué)檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)易、特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。在單重PCR 方法日漸成熟的基礎(chǔ)上，雙重或多重PCR 方法的報(bào)道也較常見，即在一個(gè)體系中加入多種引物和模板[12]，一次PCR就能檢測(cè)多種病原體，當(dāng)天就能出結(jié)果。建立雙重PCR 檢測(cè)方法關(guān)鍵在于引物的設(shè)計(jì)和篩選。首先，兩種病毒檢測(cè)的目的片段大小要有合適的梯度，確保產(chǎn)物量相對(duì)平衡，目的片段大小相差不宜超過300 bp，各引物退火溫度盡可能相近。其次，應(yīng)防止引物和模板之間的非特異性結(jié)合，盡量避免產(chǎn)生引物二聚體和防止出現(xiàn)非特性條帶[13-14]。本研究根據(jù)ANV 和ChPV 的保守基因序列設(shè)計(jì)和篩選出兩對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和體系，確定最佳引物比例分別是ANV 0.4 μL（20 mol/L）和ChPV 0.6 μL（20 mol/L）。設(shè)置50.0～60.0 ℃的退火溫度梯度，均能特異地?cái)U(kuò)增出目的片段，53.8 ℃為本研究建立的雙重PCR 方法最佳退火溫度。

通過對(duì)ANV 和ChPV 雙重PCR 的特異性和敏感性試驗(yàn)，可知該方法能同步檢測(cè)兩種病毒，而對(duì)常見的雞病病原包括AIV-H9、MDV、AILTV、IBV、NDV、ARV 和E.coli等進(jìn)行檢測(cè)，均沒有出現(xiàn)特異性目的條帶；靈敏度與單重PCR 一致，最低能檢出55 fg ANV 和58 fg ChPV，具有很高的敏感性。此方法降低了成本，節(jié)約了時(shí)間，能夠達(dá)到快速檢測(cè)這兩種雞腸道性疾病的目的。

利用本研究建立的ANV 和ChPV 雙重PCR檢測(cè)方法，對(duì)2017年11月至2018年5月采集的40份雞泄殖腔拭子進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與單重PCR 結(jié)果一致。因此，本研究建立的雙重PCR 檢測(cè)方法可用于快速檢測(cè)ANV 和ChPV 的混合感染，既可節(jié)約時(shí)間、降低成本，又能減少污染，為兩種病毒的防控提供了技術(shù)支撐。