周 暢，許常青，許方瑋，方 圓，陳 偉，文 志，林 康，王林定

卡波肉瘤(Kapos’s sarcoma，KS)是一種罕見的腫瘤，其特征是廣泛的新生血管生成、炎性細胞浸潤和內(nèi)皮來源的非典型分化梭形細胞。KS是由一種致癌的γ皰疹病毒卡波肉瘤相關皰疹病毒(Kapos sarcoma associated herpesvirus，KSHV)又稱人皰疹病毒-8(human herpes virus-8，HHV-8)引起的。KSHV于1994年由華裔科學家Chang et al[1]在KS組織中發(fā)現(xiàn)該病毒。除KS之外它與原發(fā)滲液性淋巴瘤(primary effusion lymphoma，PEL)和多中心性卡斯爾曼病(multicentric Castleman disease，MCD)有關[2]。K15P基因位于病毒基因組的右末端，編碼一個最多12次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個具有多個保守信號基序的羧基端細胞質(zhì)尾部[3]。將其中一個信號基序YEEVL位點中的Y位點突變?yōu)镕將導致其激活信號通路的效率降低，突變體被命名為K15P(YF)[4]。相關研究[5]顯示，K15P參與KS的發(fā)生發(fā)展，尤其在腫瘤的血管新生方面起到重要作用。本研究通過第三代慢病毒包裝體系包裝慢病毒，獲得高效表達K15P與K15P(YF)的慢病毒，并獲得穩(wěn)定表達K15P與K15P(YF)的內(nèi)皮細胞EA.hy926，旨在為研究K15P在內(nèi)皮細胞內(nèi)的功能及KSHV在血管新生方面的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源HEK293T細胞、EA.hy926細胞及5種質(zhì)粒：pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)、pHAGE-CMV-MCS-Puro、PSPAX2和pMD2.g均由本實驗室保存，其中pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)重組質(zhì)粒包含有K15P、K15P(YF)的全部8個外顯子序列，T-Vector購自北京TaKaRa公司。HEK293T細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的高糖DMEM(美國hyclone公司)培養(yǎng)基中，EA.hy926細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 μg /ml鏈霉素和100 U /ml青霉素的RPMI-1640(美國hyclone公司)培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶Not I、BamH I、PCR Amplification試劑盒、Mighty TA-cloning試劑盒和DL10000 DNA Marker(北京TaKaRa公司)；質(zhì)粒小提試劑盒(中量)、核酸凝膠純化試劑盒( 北京天根有限公司)；Opti-MEM(美國Gibco公司); Lip2000(美國Invitrogen公司)；兔anti-FLAG多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔IgG二抗(北京博奧森公司)；嘌呤霉素粉末(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 構(gòu)建pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS -K15P(YF)-Puro重組質(zhì)粒及鑒定

1.3.1K15P、K15P(YF)基因的擴增 根據(jù)NCBI上K15P基因序列，引物設計合成由滁州通用生物科技有限公司完成，F(xiàn)：5′-TTGCGGCCGCGCCACCATGAAGACACTCATA-3′(下劃線部分代表Not I的酶切位點)；R：5′-TTGGATCCTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGTTCCTGGGAAATAA-3′(下劃線部分代表BamH I的酶切位點)。以實驗室保存質(zhì)粒pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)為模板，使用PCR技術對目的基因擴增。反應體系共50 μl，包括pFJ-K15P或pFJ-K15P(YF)質(zhì)粒模板2 μl、PCR Premix 25 μl、ddH2O 19 μl、上游引物2 μl、下游引物2 μl。K15P反應體系：預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、20 s；退火60 ℃、20 s，延伸72 ℃、2 min，持續(xù)變性至延伸共35個循環(huán)；之后72 ℃、10 min；K15P(YF)反應體系：預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、20 s；退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、2 min，持續(xù)變性至延伸共35個循環(huán)；之后72 ℃、10 min。1%瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，切膠回收目的條帶并測定其濃度，TA克隆至T載體，藍白斑挑選白色菌落，搖菌12 h后提取質(zhì)粒，酶切初步鑒定，并送至滁州通用生物科技有限公司進行測序。

1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用Not I和BamH I雙酶切pHAGE-CMV-MCS -Puro質(zhì)粒，37 ℃、2 h，切膠回收，測定濃度。通過DNA連接酶DNA Ligation(北京TaKaRa公司)將PCR回收的K15P和K15P(YF)分別連接至線性化的pHAGE-CMV-MCS -Puro載體上并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞均勻涂布于含有異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)、X-Gal的平板中，20 h后挑取陽性克隆，擴增菌液后提取質(zhì)粒，酶切鑒定，并送至滁州通用生物科技有限公司進行測序。

1.4 慢病毒的包裝轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化HEK 293T細胞，密度調(diào)整為1×106個/ml，接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，24 h待細胞匯合度達到70%～90% 時即可進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前2 h，吸棄原有的培養(yǎng)基，換為新鮮無雙抗無血清的DMEM培養(yǎng)基。1.5 ml滅菌離心管中加入500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，其中依次加入8 μg pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro或pHAGE-CMV-MCS-K15P(YF)-Puro、 6 μg PSPAX2、 3 μg pMD2.g 輕柔混勻，室溫靜置5 min。另取一支新的1.5 ml滅菌離心管加入500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，加入34 μl Lip2000并輕柔混勻。將上述兩管溶液混勻后室溫靜置15～30 min即為轉(zhuǎn)染復合物。15～30 min后將轉(zhuǎn)染復合物混勻后加入細胞上清液中，緩慢混勻復合物與細胞培養(yǎng)基使分布均勻。轉(zhuǎn)染6 h后觀察細胞狀態(tài)并棄去培養(yǎng)基換成10 ml新鮮的完全培養(yǎng)基。細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細胞上清液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，0.45 μm針式濾器過濾，收集后置于4 ℃冰箱保存，可直接用于后續(xù)的感染實驗。

1.5 內(nèi)皮細胞的感染與篩選

1.5.1感染內(nèi)皮細胞 將EA.hy926細胞鋪于24孔板中，待細胞匯合度達到80%后，每孔加入500 μl病毒上清液與8 μg/ml Polybrene，感染4 h后棄去上清液，加入500 μl新鮮不含抗生素的完全培養(yǎng)基，24 h后傳代。

1.5.2穩(wěn)定株的篩選 將EA.hy926細胞鋪于24孔板中，待細胞匯合度達到70%后，每孔細胞加入終濃度1 μg/ml的嘌呤霉素，同時增加不使用病毒感染的野生型細胞，加入嘌呤霉素，條件與實驗組相同。每24 h觀察細胞狀態(tài)，直至不感染病毒的對照組細胞被嘌呤霉素全部殺死。

1.6 Western blot 檢測K15P 、K15P(YF)蛋白的表達將篩選后的細胞裂解、離心取上清液加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱10 min，12%的SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，1 ∶200稀釋兔抗FLAG多克隆抗體一抗，4 ℃滾動孵育過夜。次日PBST洗膜3次，1 ∶5 000稀釋辣根標記山羊抗兔的二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜3次后曝光顯影。

1.7 內(nèi)皮細胞遷移實驗使用基質(zhì)膠包被8 μm孔徑Transwell多孔膜上側(cè)，置于超凈臺中30 min使基質(zhì)膠凝固。使用前30 min加入新鮮培養(yǎng)基使小室多孔膜水化。消化細胞鋪板或加入Transwell之前讓其在無血清培養(yǎng)基環(huán)境中饑餓細胞3 h，消除血清對細胞的影響。消化重懸EA.hy926細胞，調(diào)整細胞密度至5×105/ml。取100 μl細胞懸液加入Transwell小室上室中，24孔板下室加入600 μl含20%FBS，1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12～48 h。取出Transwell小室，棄去小室中培養(yǎng)基，DPBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，使用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，棉簽輕輕擦拭小室上層未遷移細胞避免對觀察產(chǎn)生干擾，DPBS洗3遍，每個Transwell置于400倍顯微鏡下選取隨機5個區(qū)域，進行計數(shù)。

1.8 CCK-8細胞增殖活性實驗將感染了空載體慢病毒，Lenti-K15P和Lenti-K15P(YF)慢病毒的EA.hy 926細胞，分別在96孔板中鋪板。每孔約種2×103個細胞。12 h后待其貼壁，棄去原有培養(yǎng)基，加入新鮮的培養(yǎng)基與10 μl /孔的CCK-8試劑，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)4 h后，酶標儀檢測吸光度。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定以重組質(zhì)粒pFJ-K15P、pFJ-K15P(YF)為模板，設計合成相應引物，通過PCR擴增目的基因片段K15P、K15P(YF)，在約1 500 bp位置可觀察到目的條帶的出現(xiàn)，見圖1A。通過TA克隆將擴增片段連接至T載體上。經(jīng)Not I和BamH I雙酶切后出現(xiàn)線性化的T載體和K15P或K15P(YF)兩條帶，大小分別為2 692 bp和1 470 bp，見圖1B。T載體酶切回收的目的基因片段構(gòu)建至表達載體pHAGE-CMV-MCS-Puro后，Not I和BamH I雙酶切出現(xiàn)線性化的pHAGE-CMV-MCS-Puro載體和K15P或K15P(YF)兩條帶，大小分別為7 742 bp和1 470 bp，見圖1C。對重組慢病毒質(zhì)粒進行測序，與GenBank中的K15P、K15P(YF)序列比較，結(jié)果一致，證明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

圖1 K15P、K15P(YF)基因慢病毒表達載體構(gòu)建的酶切鑒定

A：K15P、K15P(YF)基因PCR擴增圖；B：T載體酶切鑒定圖；C：慢病毒表達載體酶切鑒定圖；M：DNA Marker；1、2：PCR擴增產(chǎn)物K15P、K15P(YF)基因；3、4：重組T載體質(zhì)粒T-K15P、T-K15P(YF)；5、6：重組T載體質(zhì)粒T-K15P、T-K15P(YF)酶切；7、8：重組慢病毒表達載體質(zhì)粒pCDH-CMV-K15P-Puro、pCDH-CMV-K15P(YF)-Puro；9、10：重組慢病毒表達載體質(zhì)粒pCDH-CMV-K15P-Puro、pCDH-CMV-K15P(YF)-Puro酶切

圖2 K15P、K15P(YF)表達株的篩選 ×400

A：野生型EA.hy926細胞在1 μg/ml嘌呤霉素生長狀態(tài)；B：K15P(YF)組EA.hy926細胞在1 μg/ml嘌呤霉素生長狀態(tài)；C：K15P組EA.hy926細胞在1 μg/ml嘌呤霉素生長24、36、72 h狀態(tài)；1：24 h；2：36 h；3：72 h

2.2 內(nèi)皮細胞的感染與篩選感染24 h后，將EA.hy926細胞鋪板，換上含1 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。72 h后未經(jīng)病毒感染的野生型細胞全部死亡，而K15P與K15P(YF)組細胞狀態(tài)良好。將感染并篩選后的EA.hy926細胞傳代，繼續(xù)加入嘌呤霉素進行維持性篩選培養(yǎng)。見圖2。

2.3 慢病毒感染EA.hy926細胞后K15P 、K15P(YF)蛋白的檢測將野生組和慢病毒組細胞裂解，提取總蛋白，Western blot檢測到了慢病毒組細胞K15P、K15P(YF)蛋白的表達。見圖3。

圖3 Western blot 檢測EA.hy926細胞中K15P、K15P(YF)蛋白的表達

A：空載體對照組病毒所感染細胞；B：K15P慢病毒組病毒所感染細胞；C：K15P(YF)慢病毒組病毒所感染細胞

2.4 K15P促進內(nèi)皮細胞EA.hy 926增殖和遷移使用表達K15P、K15P (YF)蛋白的EA.hy926細胞與空載體包裝的慢病毒感染的EA.hy926細胞進行Transwell遷移實驗與CCK8增殖活性實驗。Transwell遷移實驗顯示，三組細胞遷移量差異有統(tǒng)計學意義(F=113.5，P<0.01)，與空載體組和K15P(YF)組(0.98±0.23)比較，K15P組(2.25±0.15)的EA.hy926細胞的遷移能力明顯增強(P<0.01)。CCK8增殖活性實驗顯示，三組細胞增殖活性差異有統(tǒng)計學意義(F=40.78，P<0.01)，與空載體組和K15P (YF)組(109.23±12.58)比較，K15P組(138.69±7.47)的EA.hy926細胞的增殖能力明顯增強(P<0.01)。見圖4。

3 討論

KSHV又稱HHV-8，于1994年首次在KS組織中發(fā)現(xiàn)，KSHV的基因組結(jié)構(gòu)與猴皰疹病毒相似，屬于γ皰疹病毒亞科。KSHV與KS發(fā)生密切相關。KS有地域型、經(jīng)典型、移植型和AIDS相關型4種不同的類型，4種類型的KS組織中含有相同的梭形細胞，這種內(nèi)皮來源的梭形細胞具有增殖作用，是KS形成的主要因素[6]。我國KS類型為經(jīng)典型，西北地區(qū)KS發(fā)病率較高，而在其他區(qū)域發(fā)病較罕見[7-8]。

K15主要有兩種等位基因：P和M[9]，兩者存在65%的保守區(qū)域，KS病例中主要是P型。K15P基因位于病毒基因組的右端，編碼一個最多12次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個具有多個保守信號基序的羧基端細胞質(zhì)尾部[10]。羧基端細胞質(zhì)尾部包括兩個SH2結(jié)合位點(VFGYASI和DDLYEEV)[11]，一個富含脯氨酸的SH3結(jié)合位點和一個TRAF結(jié)合位點[12]。K15P通過激活JNK、ERK、MAPK等信號通路來促進KSHV介導的血管生成[13-15]。DDLYEEV結(jié)合位點的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?K15P(YF))會導致K15P介導的下游信號受損。

圖4 K15P促進內(nèi)皮細胞EA.hy 926的增殖和遷移 ×400

A：Transwell遷移實驗空載體病毒感染的EA.hy926細胞遷移；B：Transwell遷移實驗表達K15P(YF)蛋白的EA.hy926細胞遷移；C：Transwell遷移實驗表達K15P蛋白的EA.hy926細胞的遷移；D：Transwell遷移實驗數(shù)據(jù)分析；E：CCK-8細胞增殖實驗檢測三組細胞的增殖活性；與空載體組比較：**P<0.01；與突變體組比較：##P< 0.01

使用慢病毒感染與普通的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法相比，其操作復雜周期長，但慢病毒可以將目的基因整合到目的細胞基因組中。此外內(nèi)皮細胞本身就是KSHV的靶細胞，普通的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法難以使內(nèi)皮細胞表達K15P，為了研究K15P在內(nèi)皮細胞中的機制，采用了慢病毒包裝的方式使內(nèi)皮細胞表達K15P。本實驗構(gòu)建含有K15P、K15P(YF)基因片段的慢病毒表達載體，成功建立可以高效表達K15P蛋白及其突變體的第三代慢病毒系統(tǒng)。通過使用包裝獲得的病毒顆粒成功感染EA.hy926細胞，嘌呤霉素篩選得到具有嘌呤霉素抗性的細胞株，Western blot 檢測到EA.hy926細胞內(nèi)表達的K15P及其突變體K15P(YF)蛋白。Transwell與CCK8實驗也證實K15P蛋白促進了細胞增殖遷移，預示K15P蛋白可能在KS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為研究K15P蛋白在內(nèi)皮細胞的功能與KSHV的致病機制奠定了一定的實驗基礎。