X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白在胰腺癌組織中的表達及與患者預后的關系研究

秦學潛，翁 皖，郭晶晶，吳 鋼

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，約90%的胰腺癌為起源于胰腺上皮的導管腺癌，5年生存率不足5%，預后極差[1]。盡管在過去的20年間人們付出很大努力，其發(fā)病率和病死率近年來仍明顯上升。預計到2030年，胰腺癌將成為全球第2位癌相關的死因[2]。胰腺癌的病因尚不十分清楚，其發(fā)生可能與吸煙、飲酒、高脂及高蛋白飲食等有關，又由于早期沒有特殊癥狀易被忽視而導致沒有被及時診斷。因此，從分子水平探究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機制，在胰腺癌的診治與預后過程中尋找一種高特異性的診斷及預后指標，對提高胰腺癌患者生存率至關重要。X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白(Zinc-finger protein X-linked，ZFX)是鋅指蛋白家族的一員，在調控基因表達、細胞分化及胚胎發(fā)育等過程中扮演著重要角色[3]。最新研究[4]表明，ZFX不僅參與細胞的自我更新，而且可以促進惡性腫瘤的增殖、凋亡和遷移。但其與胰腺癌的相關性報道較少，這可能是由于對ZFX和胰腺癌之間的認知和研究依然在起步的階段。為此，該研究采用免疫組化和Western blot檢測ZFX蛋白在胰腺癌中的表達，發(fā)現(xiàn)其在生物學特性上對胰腺癌的影響，探討其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義，評價ZFX作為胰腺癌患者預后指標的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料60例配對的胰腺癌組織及癌旁無瘤組織均為上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院普外科2008年1月～2012年12月手術切除標本，均經病理學證實。所有患者術前均未化療或放療，有完整的臨床病理資料。男28例，女32例，年齡≥60歲的33例，<60歲的27例，平均年齡為70.6歲；按AJCC7胰腺癌TNM分期標準：0期2例，Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例，Ⅳ期12例；病理證實均為胰腺癌，按Edmondson’s標準[5]：高分化20例，中分化24例，低分化16例。所有標本的收集均經患者知情同意，并在手術切除后立即采集2份，1份置于滅活RNA酶的凍存管中液氮冷凍保存，另1份經10%甲醛固定后石蠟包埋。

1.2 主要試劑鼠抗人ZFX單克隆試劑抗體購自美國Abcam公司(稀釋濃度1 ∶200)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋濃度1 ∶500)、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；山羊抗鼠IgG(稀釋濃度1 ∶100)、通用型SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒和supersignal發(fā)光試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組化和結果判定 ZFX蛋白陽性信號定位于細胞核，因此以細胞核染色呈棕黃色為陽性，對染色的程度進行評分。細胞染色程度：陰性為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分；在高倍鏡下對切片進行觀察并記錄著色細胞的比例，著色細胞占記數(shù)細胞的百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分，將每張切片染色程度得分與染色細胞百分率得分各自相加為其最后得分:0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3分為陽性(++)，4～6分為強陽性(+++)。為統(tǒng)計方便，最終將++～+++定義為陽性，而其他定義為陰性[6]。

1.3.2Western blot分析 稱取100 mg胰腺癌組織，按組織和細胞裂解液1 ∶10的比例加入全細胞裂解液，于冰上勻漿器充分勻漿后12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液提取總蛋白，用酶標儀于592 nm波長行Bin-choninic Acid (BCA法)蛋白定量。煮沸(使蛋白變性)8 min后，按每孔60 μg蛋白量上樣，以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V恒壓跑至分離膠后，電壓調至120 V直至分離膠底部，后經半干轉膜法以1～1.5 mA/cm2恒流電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PVDF膜置于一抗稀釋液(1 ∶1 000稀釋)中4 ℃過夜，PBST及PBS洗膜10 min×3次，再置于二抗稀釋液(1 ∶1 000稀釋)中室溫孵育2 h，PBST及PBS洗膜10 min×3次，加入化學發(fā)光底物(super signal west)，顯影，β-actin作為內參照，用Quantity One 4.3.1凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描ZFX蛋白灰度值，取不同泳道蛋白的灰度值與相應內參β-actin的比值代表各蛋白的相對表達水平，進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 免疫組化檢測ZFX蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達情況ZFX蛋白的表達位于組織細胞的細胞核。胰腺癌組織中ZFX蛋白的陽性反應呈染色均一的棕黃色或棕褐色顆粒，陽性率為63.3%(38/60)；而癌旁組織也可見ZFX蛋白的陽性表達，但反應顏色較淺，呈淺黃色，陽性率為36.7%(22/60)，明顯低于相應癌組織(P<0.001)，圖1A-C。

2.2 Western blot方法檢測ZFX蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的表達情況ZFX蛋白在胰腺癌組和癌旁組中的相對表達量分別為(0.61±0.05)和(0.25±0.08)，兩組之間蛋白的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=8.311，P<0.05)。見圖2。

圖1 ZFX蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達

A：癌旁組織中ZFX蛋白陰性表達；B：胰腺癌組織中ZFX蛋白陽性表達(+++)；C：胰腺癌及癌旁組織中ZFX蛋白表達強度評分；與胰腺癌組織比較：***P<0.001

圖2 Western blot法檢測ZFX蛋白在部分胰腺癌及癌旁組織中的表達

T：胰腺癌組織；A：癌旁組織；1～4：任意選取4對胰腺癌組織及癌旁組織

2.3 ZFX蛋白表達與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關系胰腺癌組織中ZFX蛋白的表達水平與胰腺癌患者的年齡、性別、分化程度和腫瘤大小、部位等臨床病理指標均不相關(P>0.05)，而與腫瘤的TNM分期和淋巴轉移有關(P<0.01)，見表1。

2.4 胰腺癌ZFX表達與預后的關系60例獲得隨訪患者中，ZFX蛋白陰性的胰腺癌患者的總生存中位時間為16.5個月(95%CI：10.83～22.17)，ZFX陽性表達患者總生存中位時間為7.0個月(95%CI：5.87～8.13)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(Log-rank值=17.784，P<0.001)。見圖3。

表1 ZFX蛋白表達與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關系

圖3 ZFX陽性表達與陰性表達胰腺癌患者的生存曲線

3 討論

ZFX是鋅指蛋白家族的一員，其含有13個C2H2的鋅指結構。ZFX基因位于哺乳動物的X染色體上，其表達在哺乳動物中呈高度保守性，其結構包含一個酸性轉錄激活區(qū)、一個核定位序列及一個DNA結合位點。由于其自身的結構特點，鋅指蛋白可以選擇性地結合特異的靶結構，在基因的表達調控、細胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用[7]。ZFX在多種干細胞的自我更新和抗凋亡機制中起著重要作用[8]。近來研究[9-11]發(fā)現(xiàn)ZFX在前列腺癌、腦癌、腦膠質細胞瘤、喉癌、胃癌、淋巴瘤等多種人類惡性腫瘤中過表達，在致癌轉化中起重要作用。如在非小細胞肺癌中，ZFX可以通過調節(jié)MMP2的表達促進肺癌細胞的侵襲轉移，而此過程需要PI3K/Akt和STAT3的參與[11]。在膽囊癌中，miR-101通過直接作用于ZFX的啟動子，抑制ZFX的表達，從而阻斷TGF-β/Smad誘導的上皮間質轉化[9]。

本研究免疫組化和Western blot結果均顯示胰腺癌組織中存在ZFX蛋白的異常高表達，即ZFX蛋白在胰腺癌組織中的表達率(63.3%)顯著高于癌旁組織(36.7%)，其在胰腺癌組織中的表達量(0.61±0.05)也顯著高于癌旁組織(0.25±0.08)，提示ZFX可能在胰腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。在與胰腺癌臨床病理相關性研究發(fā)現(xiàn)ZFX蛋白的過表達與胰腺癌的TNM分期及淋巴轉移密切相關，TMN分期中Ⅱ～Ⅳ期的ZFX陽性率明顯高于0～Ⅰ期，提示ZFX的表達與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，即ZFX可能參與了胰腺癌的惡性進展過程。

另有研究[4]發(fā)現(xiàn)ZFX可促進膽囊癌細胞的增殖和侵襲轉移，臨床資料顯示ZFX是膽囊癌獨立預后因素。ZFX作為miR-144下游一個重要效應分子參與胃癌的骨轉移，并且體外實驗提示上調miR-144還可以抑制ZFX來促進胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。細胞功能實驗表明，ZFX可以通過調控ERK-MAPK信號通路促進胃癌細胞株SGC7901和MGC803的增殖和抑制其凋亡[12-13]。Lai et al[14]發(fā)現(xiàn)在肝細胞肝癌組織中，ZFX蛋白和信使RNA的水平顯著高于癌旁非腫瘤組織。ZFX siRNA抑制人肝癌細胞的增殖，誘導細胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯，促進細胞的凋亡。這些研究體現(xiàn)了ZFX在惡性腫瘤中的重要功能。在胰腺癌研究領域，該分子與胰腺癌臨床病理特征及預后的關系鮮有報道[15]。本研究中Kaplan-Meier生存曲線分析結果提示ZFX表達陽性的患者的總體生存率明顯低于陰性患者，提示ZFX是胰腺癌預后影響因素，因此一定程度上可以作為胰腺癌預后的預測指標。

綜上所述，研究中ZFX蛋白在胰腺癌中高表達，與胰腺癌侵襲轉移密切相關。胰腺癌組織中ZFX表達陰性者預后優(yōu)于表達陽性者，或許可作為胰腺癌預后獨立預測指標，有助于對預后作出指導和預后情況的及時了解。然而對于ZFX作用、分子機制仍需進一步研究，以期為探討胰腺癌發(fā)病的分子機制提供幫助，也為胰腺癌的靶向治療提供新的思路。