樊一喬， 安 然,2**， 李 琦， 李 敬， 梁興國,2

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266235)

環(huán)狀DNA具有線性DNA不具備的動力學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)特點，因此環(huán)狀DNA作為DNA納米技術(shù)的重要組成部分被人們廣泛關(guān)注[1-3]。Zheng等[4]以單鏈環(huán)狀DNA為基本單元成功制備了DNA納米管結(jié)構(gòu)；多個課題組以單鏈環(huán)狀DNA為原料，制備了2個或多個DNA環(huán)相互穿套的連環(huán)結(jié)構(gòu)(Catenane)，并將其制備成可控的分子開關(guān)或分子機器等[1,3,5-7]。相對于線性DNA，環(huán)狀DNA不易被核酸外切酶降解，在溶液中單一分散、不易聚合，這些特性決定了其在藥物運輸、基因調(diào)控、疾病診斷和基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用更具優(yōu)越性[4,8-10]。此外，單鏈環(huán)狀DNA還與滾環(huán)擴增技術(shù)等以環(huán)狀DNA為元件的核酸檢測技術(shù)密切相關(guān)[5,11-12]。因此，單鏈環(huán)狀DNA在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)等方面應(yīng)用廣泛。

然而，單鏈環(huán)狀DNA難以大量制備成為了目前制約以環(huán)狀DNA研究和應(yīng)用的一個難題。通常，其制備是利用一條與單鏈DNA兩端互補的DNA短鏈(Splint)，使單鏈DNA兩端靠近，在連接酶作用下使單鏈封閉成環(huán)(見圖1A)。但在生成由一條單鏈DNA首尾相接的單倍環(huán)的同時，也會產(chǎn)生由多條單鏈DNA首尾相接生成的副產(chǎn)物(見圖1B、C)，且隨著單鏈DNA濃度的增大，副產(chǎn)物的比例會急劇增加。因此為減少副產(chǎn)物產(chǎn)生，目前在大多數(shù)研究中，單鏈DNA濃度不超過0.5 μmol/L甚至為nmol/L級別[1,8,13-15]，這就使得單鏈環(huán)狀DNA的產(chǎn)量受到制約，從而增加了對其研究和應(yīng)用的難度。

針對上述問題，且考慮到已成環(huán)產(chǎn)物的存在不影響環(huán)化反應(yīng)，An等[16]提出了一種新型的逐步添加法成環(huán)，即每次向成環(huán)體系中加入少量單鏈DNA，使其在低濃度下充分成環(huán)后再次加入單鏈DNA，重復(fù)多次，這樣可使單鏈DNA的成環(huán)濃度始終處于較低水平的同時，最終累積得到高濃度的單鏈環(huán)狀DNA(見圖2)。然而，該研究并未深入探討利用逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA時的影響因素和具體制備條件的確定方法。因此本文擬圍繞逐步添加法成環(huán)過程中，連接酶Buffer濃度、單鏈DNA的添加濃度、添加間隔時間、反應(yīng)溫度等多方面因素進行探討，找到逐步添加法的關(guān)鍵因素，以指導(dǎo)逐步添加法中各條件的確定方法，為單鏈環(huán)狀DNA的高效大量制備提供技術(shù)支持。

圖1 單鏈環(huán)狀DNA的制備(A)及制備時產(chǎn)生的副產(chǎn)物(B和C)

圖2 逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA示意圖

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

T4 DNA 連接酶、10× T4 DNA 連接酶Buffer(400 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L MgCl2，100 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP(pH=7.8，25℃))購于Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Green Ⅱ購于Sigma公司；DNA單鏈(見表1)由蘇州金唯智生物科技公司合成；其他實驗試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；PCR儀購于杭州博日科技有限公司；旋轉(zhuǎn)式真空濃縮機購于德國Marin Christ公司；真空泵購于美國圣斯特公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置購于北京六一儀器廠；凝膠成像儀購于BIO-RAD公司。

表1 連接成環(huán)所用的單鏈DNA及短鏈Splint序列

Note: Splint-L1, Splint-L2, Splint-L3 assist the oligonucleotides L1-72, L2-67, L3-33 in ligating, respectively; The underlined and double underlined sequences of Splint-L1, Splint-L2, Splint-L3 combine with the underlined and double underlined sequences of oligonucleotides L1-72, L2-67, L3-33, respectively.

1.2 一步法連接成環(huán)反應(yīng)

20 μL的總反應(yīng)體系：0.1× T4 DNA連接酶Buffer(4 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.05 mmol/L ATP(pH=7.8，25 ℃))，0.5 μmol/L 5’端磷酸化的單鏈DNA，1 μmol/L Splint短鏈DNA，5 Weiss U T4 DNA連接酶。連接反應(yīng)前先將上述組分混勻后置于PCR儀中，30 ℃反應(yīng)10～60 min，65 ℃ 10 min使連接酶變性。典型的連接反應(yīng)條件為：0.1× T4 DNA連接酶Buffer，0.5 μmol/L 5’端磷酸化的單鏈DNA，單鏈DNA與Splint的摩爾濃度比例為1∶2，5 Weiss U T4 DNA連接酶。

1.3 逐步添加法連接成環(huán)反應(yīng)

管1為制備液體系(20 μL)：10 Weiss U T4 DNA連接酶，8 μmol/L Splint短鏈DNA，0.1× T4 DNA連接酶Buffer(4 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.05 mmol/L ATP(pH=7.8，25 ℃))；管2為添加液體系(20 μL)：0.1× T4 DNA連接酶Buffer(4 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.05 mmol/L ATP(pH=7.8，25 ℃))，4 μmol/L 5’端磷酸化的單鏈DNA。每間隔一定時間向管1制備液體系(只含Splint)加入管2的添加液(只含成環(huán)單鏈DNA)，分10次添加，以確保每次加入的單鏈DNA充分反應(yīng)成環(huán)；添加液添加完畢后延長反應(yīng)5～10 h后結(jié)束反應(yīng)；反應(yīng)溫度為25 ℃。

1.4 產(chǎn)物分析

連環(huán)產(chǎn)物濃度較低(如0.1～0.5 μmol/L)時，為使產(chǎn)物更易檢測，需要將產(chǎn)物進行真空濃縮，然后加少量水復(fù)溶至1 μmol/L。產(chǎn)物用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。SYBR Green II染色10～15 min后利用凝膠成像儀成像。用Image Lab軟件定量分析條帶亮度，計算每條泳道中單鏈環(huán)狀DNA條帶占所有條帶的百分比，得出連接產(chǎn)物中單鏈環(huán)狀DNA的產(chǎn)率。

2 結(jié)果

2.1 T4 DNA連接酶Buffer的濃度對成環(huán)的影響

為探究各種因素對成環(huán)效率及副產(chǎn)物產(chǎn)生的影響，本研究選取了一條72 nt的單鏈DNA(L1-72)用于成環(huán)實驗，其兩端不具有穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，不會干擾與Splint結(jié)合。Splint長度為12 nt，各有6 nt與成環(huán)鏈的兩端互補。由于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，DNA單鏈連接成環(huán)后遷移速率變慢，可與DNA單鏈顯著區(qū)分開。An等[16]提出低濃度Buffer能減少成環(huán)副產(chǎn)物產(chǎn)生，是逐步添加法中不可忽視的因素之一。因此為確定逐步添加法過程中Buffer濃度，本研究探究了7種不同的T4 DNA連接酶Buffer濃度對連接成環(huán)的影響。圖3結(jié)果顯示，Buffer濃度對DNA的成環(huán)影響顯著，當(dāng)濃度大于0.1×?xí)r，副產(chǎn)物開始出現(xiàn)；當(dāng)濃度為0.01×?xí)r，連接酶效率急劇降低，僅有極少量的環(huán)狀DNA產(chǎn)生。因此，適宜的T4 DNA連接酶Buffer濃度為0.1～0.05×。本實驗選擇0.1× T4 DNA連接酶Buffer作為最終逐步添加法的Buffer濃度。

(泳道 1～7：T4 DNA 連接酶 Buffer濃度分別為2～0.01×；泳道 8：L1-72；25 ℃連接6 h。Lane 1-7: The concentration of T4 DNA Ligase Buffer is 2～0.01×; Lane 8: L1-72; Ligation at 25 ℃ for 6 h.)

圖3 不同濃度T4 DNA連接酶Buffer對成環(huán)的影響

Fig.3 Effects of the concentration of T4 DNA Ligase Buffer on the yield of single-stranded DNA rings

2.2 單鏈DNA的濃度對成環(huán)的影響

利用逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA時，DNA濃度是影響成環(huán)效率的重要因素之一，控制成環(huán)體系中單鏈DNA的恒定濃度是減少副產(chǎn)物產(chǎn)生的關(guān)鍵，因此本研究探究了6種不同的單鏈DNA濃度對成環(huán)的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)單鏈DNA的濃度大于0.5 μmol/L時，連接產(chǎn)物中均有副產(chǎn)物出現(xiàn)；當(dāng)單鏈DNA的濃度小于或等于0.5 μmol/L時，產(chǎn)物均只有單鏈環(huán)狀DNA(見圖4)。也就是說，對于L1-72鏈，逐步添加法每次向制備液體系加入添加液后，單鏈DNA的濃度需保持在0.5 μmol/L以下，以避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生與積累。

2.3 添加間隔時間對成環(huán)效率的影響

在逐步添加法中，若2次添加單鏈DNA之間的間隔時間過短，則會使剩余單鏈DNA較多，累積超過一定濃度后可能導(dǎo)致副產(chǎn)物產(chǎn)生。圖5中表示不同反應(yīng)時間下的環(huán)狀DNA產(chǎn)率。結(jié)果顯示，反應(yīng)時間在10～15 min時，單鏈環(huán)狀DNA的收率均低于70%，體系中剩余成環(huán)單鏈DNA較多；而當(dāng)反應(yīng)時間大于或等于20 min后，單鏈環(huán)狀DNA的收率可達89%且趨于穩(wěn)定。因此，對于成環(huán)單鏈L1-72，逐步添加法的添加間隔時間應(yīng)控制在20 min以上。

2.4 反應(yīng)溫度對成環(huán)效率的影響

反應(yīng)溫度是影響單鏈DNA連接成環(huán)的因素之一，溫度會影響酶的活性以及Splint和單鏈DNA的結(jié)合從而影響環(huán)狀結(jié)構(gòu)的收率。本研究探究了5種不同反應(yīng)溫度對成環(huán)速率的影響，不同溫度下連接15 min的結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，當(dāng)溫度為25 ℃時，單鏈環(huán)狀DNA的收率最高，達到了78%；而其他溫度下單環(huán)的收率相對較小，如37 ℃時連接成環(huán)的效率僅為21%，成環(huán)率遠(yuǎn)低于25 ℃。因此對于單鏈DNA L1-72，制備環(huán)狀結(jié)構(gòu)時最佳溫度為25 ℃，后續(xù)實驗也均在該條件下進行。

2.5 Splint加入量和Splint的GC含量對成環(huán)效率的影響

Splint與成環(huán)單鏈DNA的比例及Splint GC含量可能會影響Splint與單鏈DNA的結(jié)合效率，從而影響單鏈環(huán)狀DNA的產(chǎn)率。因此，本研究考察了二者對于環(huán)狀DNA產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)Splint與單鏈DNA比例為0.5∶1～10∶1時，產(chǎn)物中均只有環(huán)狀結(jié)構(gòu)條帶，未產(chǎn)生副產(chǎn)物。這表明，在逐步添加法中可一次性加入高濃度Splint，不需分次添加。

(泳道 1～6：單鏈DNA終濃度分別為5～0.1 μmol/L；泳道 7：L1-72；30 ℃反應(yīng)6 h。Lane 1～6: The concentration of the single-stranded DNA is 5～0.1 μmol/L; Lane 7: L1-72; Ligation at 30 ℃ for 6 h.)

圖4 不同濃度單鏈DNA制備環(huán)狀結(jié)構(gòu)的電泳結(jié)果

Fig.4 Effects of the concentration of the single-stranded
DNA on preparing of single-stranded DNA rings

(A：泳道 1～5：單鏈DNA L1-72分別反應(yīng)10～60 min；泳道 6：L1-72。 A: Lane 1～5: The time of the single-stranded DNA for ligation into circular DNA is 10～60 min; Lane 6: L1-72.)

圖5 添加間隔時間對成環(huán)效率的影響

Fig.5 Effects of the time interval for dropwise on the yield of single-stranded DNA rings

當(dāng)Splint的GC含量適中時(50%)，單鏈DNA成環(huán)效果最好；Splint的GC含量過高或過低均會降低連接效率。Splint GC含量較低時(33%)，其與單鏈DNA結(jié)合部分熔點低，在較高的連接溫度下二者難以結(jié)合，如隨著溫度升高，Splint GC含量較低(33%)的單環(huán)得率急劇下降(30 ℃僅為8%)。因此，在設(shè)計成環(huán)單鏈末端位置時，應(yīng)選擇適中的GC含量(Splint的GC含量為50%左右)。

(A：泳道1～5：反應(yīng)溫度分別為16～37 ℃；泳道 6：L1-72；反應(yīng)時間15 min。A: Lane 1～5: The temperature is 16～37 ℃; Lane 6: L1-72; The time of Ligation is 15 min.)

圖6 反應(yīng)溫度對單鏈環(huán)狀DNA收率的影響

Fig.6 Effects of the temperature on the yield of single-stranded DNA rings

(A：泳道 1～5中L1-72與Splint-L1的比例為：0.5∶1～10∶1；泳道 6：L1-72；25 ℃連接10 h。B：泳道 1～3、5～7、9～11：20～30 ℃時，GC含量不同的Splint對單鏈DNA L1-33、L1-72、L1-67成環(huán)效率的影響；連接時間15 min。A: Lane 1～5: The ratio of Splint-L1 to single-stranded DNA is 0.5∶1～10∶1; Lane 6: L1-72; Ligation at 25 ℃ for 10 h. B: Lane 1～3, 5～7, 9～11: Impact of GC content of the splint on the yield of single-stranded DNA rings when the temperature is 20～30 ℃; The time of ligation is 15 min.)

圖7 Splint對單鏈環(huán)狀DNA收率的影響

Fig.7 Influence of the Splint on the yield of single-stranded DNA rings

2.6 常規(guī)一步法與逐步添加法對比

根據(jù)上述結(jié)果，針對L1-72單鏈DNA，逐步添加法中應(yīng)考慮的關(guān)鍵條件為：0.1× T4 DNA連接酶Buffer、添加間隔時間為20 min、反應(yīng)溫度為25 ℃。根據(jù)此條件，圖8中對比了將所有單鏈DNA和其他輔助試劑(包括Splint、連接酶等)一次性加入成環(huán)體系中的常規(guī)一步法和逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA的結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)，一步法連接產(chǎn)物中，均有副產(chǎn)物產(chǎn)生，單鏈環(huán)狀DNA得率分別為78%(1×Buffer)和86%(0.1×Buffer)，而利用逐步添加法制備單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)狀DNA的產(chǎn)率達99%。

3 討論

本文針對逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA，探究了單鏈DNA濃度、添加間隔時間等因素對制備單鏈環(huán)狀DNA的影響，得出了影響逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA的關(guān)鍵因素。其中，T4 DNA連接酶Buffer濃度、逐次加入后體系中單鏈DNA濃度、添加間隔時間、溫度、Splint GC含量是逐步添加法制備環(huán)狀結(jié)構(gòu)時的必需考慮條件，是減少或避免副產(chǎn)物產(chǎn)生的關(guān)鍵，而Splint與單鏈DNA比例(0.5∶1～10∶1)、酶使用量在一定范圍內(nèi)(1～10 Weiss U)對成環(huán)效率影響不大。

(泳道 1：L1-72；泳道 2為逐步添加法制備結(jié)果；泳道 3～4為一步法連接結(jié)果；泳道 2～4：T4 DNA 連接酶Buffer濃度分別是0.1×、0.1×和1×；L1-72終濃度2 μmol/L；25 ℃連接10 h；逐步添加法中，每隔20 min向制備液體系中加入一定量的添加液，分10次添加。Lane 1: L1-72; Lane 2: The result of preparation of single-stranded DNA rings by “Step-by-Step” method; Lane 3～4: The result of conventional “One-Step” cyclization; Lane 2～4: The concentration of the T4 DNA Ligase Buffer is 0.1×, 0.1× and 1×; The concentration of the single-stranded DNA is 2 μmol/L; Ligation at 25 ℃ for 10 h; Add the additive solution into the preparation system every 20 min for 10 times in the “Step-by-Step” method.)

圖8 一步法與逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA的結(jié)果比較

Fig.8 Comparision of single-stranded DNA rings
prepared by different methods

本研究發(fā)現(xiàn)，T4 DNA連接酶Buffer濃度對于副產(chǎn)物的產(chǎn)生影響較大，隨著T4 DNA連接酶Buffer濃度降低，副產(chǎn)物急劇減少，這與An等[16]的研究結(jié)果一致。Mg2+是T4 DNA連接酶的依賴型輔因子[17-18]，在低Mg2+濃度下，T4 DNA連接酶催化活性不受明顯影響，同時還可以降低副產(chǎn)物產(chǎn)生[16]。當(dāng)使用0.1～0.05× Buffer時，Mg2+濃度處于較低水平(0.5～1 mmol/L)，由于DNA帶負(fù)電荷而使得分子間斥力變大，分子間的連接效率受到約束，從而抑制了副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

當(dāng)L1-72濃度高于0.5 μmol/L時，連接產(chǎn)物中會出現(xiàn)副產(chǎn)物，這是因為體系中單鏈DNA濃度增高，分子間距離減小，碰撞幾率增大，分子內(nèi)連接成環(huán)的同時分子間連接的幾率同時增大，產(chǎn)生大分子副產(chǎn)物；反之則分子間接觸幾率降低，以分子內(nèi)連接為主，反應(yīng)更傾向于自身環(huán)化。同時，添加間隔時間若過短，則體系中尚有未連接的單鏈DNA，再次加入單鏈DNA后導(dǎo)致未反應(yīng)的底物濃度產(chǎn)生積累，多次積累后濃度達到較高水平，則同樣會增加分子間反應(yīng)幾率，導(dǎo)致副產(chǎn)物產(chǎn)生。由于在不同條件下，連接酶效率不同，因此在制備不同單鏈環(huán)狀DNA時，逐步添加法的添加間隔時間需要通過實驗進行確定。

另外，當(dāng)溫度為25 ℃時，L1-72連接得到單鏈環(huán)狀DNA的收率最高，這可能是由于在25 ℃時酶活較高，且該溫度下Splint與成環(huán)單鏈DNA的雜交程度較好，因而在逐步添加法中，溫度對單鏈環(huán)狀DNA制備效率的影響較大，需要通過實驗進行確定；而酶活不受明顯影響時，Splint的GC含量會影響成環(huán)效率。Splint的GC含量適中時，Splint與單鏈DNA雜交情況較好，可能會使連接過程中的腺苷化、去腺苷化反應(yīng)[17]速率更快速，使單環(huán)收率增高；若Splint GC含量過低或過高，均有可能降低連接效率，可考慮適當(dāng)延長反應(yīng)時間。而Splint與單鏈DNA的比例、連接酶使用量并不影響單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)收率，與An等[16]方法相比，Splint及T4 DNA連接酶在逐步添加法中可在初始時一次性加入制備液中，不需分次添加，進一步簡化了逐步添加法步驟，提高了制備效率。

以單鏈DNA L1-72為例，逐步添加法可使制備2 μmol/L的單鏈環(huán)狀DNA的產(chǎn)率達99%。當(dāng)成環(huán)體系為1 mL時，產(chǎn)量可達46.3 μg，相比于傳統(tǒng)的制備方法(0.5 μmol/L，產(chǎn)率為81%，見圖3 泳道 2)，產(chǎn)量可提高至4.9倍。當(dāng)成環(huán)鏈0.5 μmol/L時，雖然應(yīng)用常規(guī)一步法在低濃度下也可制備得到產(chǎn)率較高的單鏈環(huán)狀DNA，但后續(xù)的旋蒸、醇沉等濃縮步驟不僅操作復(fù)雜，還會造成產(chǎn)物的一定損失，難以達到高效、大量制備的效果；而使用逐步添加法制備的高濃度環(huán)狀DNA，可直接用于常規(guī)實驗，顯著提高制備效率，為以單鏈環(huán)狀DNA為基礎(chǔ)的研究提供極大便利。

4 結(jié)語

本文研究了單鏈環(huán)狀DNA制備過程中各主要因素對單鏈環(huán)狀DNA制備的影響，確定了逐步添加法制備過程中的關(guān)鍵條件，能夠為逐步添加法的具體過程提供指導(dǎo)，從而實現(xiàn)大量單鏈環(huán)狀DNA的高效制備。對于一條隨機的DNA單鏈，利用逐步添加法大量制備環(huán)狀結(jié)構(gòu)時，應(yīng)考慮的主要關(guān)鍵因素為：T4 DNA連接酶Buffer濃度、每次加入后單鏈DNA濃度、添加間隔時間、溫度、Splint GC含量。本研究為單鏈環(huán)狀DNA的制備提供了技術(shù)參考，從而能夠為以單鏈環(huán)狀DNA為基礎(chǔ)的納米結(jié)構(gòu)技術(shù)、核酸檢測及疾病診斷治療等研究奠定基礎(chǔ)。