復合蛋白酶水解螺旋藻制備多肽的工藝優(yōu)化

潘進權(quán) 周鮮嬌 蔣 邊 黃思恒

(嶺南師范學院生命科學與技術學院，湛江 524048)

螺旋藻又名藍細菌，是一種微藻，屬于低等原核生物，具有很強的生存能力，易于繁殖及規(guī)模化培養(yǎng)[1]。螺旋藻自身含有各種豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[2,3]：已有研究表明，螺旋藻干粉中蛋白的含量高達60%～70%，幾乎是大豆的兩倍；而且螺旋藻蛋白的氨基酸組成比例非常均衡，尤其是含硫氨基酸較突出，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[4]；除此外，螺旋藻還含有較豐富的不飽和脂肪酸，維生素，礦物質(zhì)和多糖。因此，螺旋藻在功能性食品、飼料加工及食品生產(chǎn)等領域均有較好的應用潛力[5-7]。

相比于其他營養(yǎng)成分而言，螺旋藻蛋白是藻體中含有的最主要物質(zhì)，其開發(fā)利用對于螺旋藻資源具有重要的意義。然而，由于螺旋藻蛋白存在于藻體內(nèi)，是一種細胞內(nèi)蛋白，若直接以螺旋藻作為原材料進行食品或飼料的加工，因藻體有較堅固的細胞壁，胞內(nèi)蛋白受到細胞壁的保護，其釋放到細胞外的效率較低，這在很大程度上限制了螺旋藻蛋白的有效利用及營養(yǎng)價值的發(fā)揮[8]。因此，國內(nèi)外學者較多的研究都集中在螺旋藻蛋白的提取及加工性能等方面，僅有少數(shù)幾篇文獻涉及到螺旋藻蛋白的單一酶解及抗氧化肽制備工藝[9,10]；而對于螺旋藻蛋白經(jīng)酶解高效轉(zhuǎn)化為多肽制品的生產(chǎn)工藝，尤其是復合蛋白酶的水解工藝涉及較少。已有研究顯示，蛋白質(zhì)原料經(jīng)酶解得到的多肽制品具有比原料蛋白及氨基酸混合物更優(yōu)越的食品加工性能及營養(yǎng)價值[11-13]；而且多肽制品通常具有一定的生理保健功能，如抗氧化[15,16]、抗腫瘤[17,18]、增強免疫力等。因此，作為一種新型的氮素營養(yǎng)物質(zhì)，多肽制品具有更廣闊的市場空間[19,20]。為提高螺旋藻蛋白資源的利用率，本研究考察了酶解螺旋藻高效制備多肽的工藝路線，首先從蛋白酶入手，篩選適合于螺旋藻蛋白水解的復合蛋白酶；然后對酶解工藝條件進行優(yōu)化，其研究結(jié)果將為螺旋藻蛋白多肽制品的加工與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻(蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為70.82%)，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，微生物堿性蛋白酶、微生物中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶、桔青霉蛋白酶由實驗室制備。其他試劑均為分析純。

AX224ZH/E電子天平；K9860全自動凱氏定氮儀；SH220N石墨消解儀；FE20酸度計；L550臺式低速大容量離心機；723N可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 螺旋藻的酶解工藝流程

配制螺旋藻粉液→調(diào)節(jié)pH值→超聲波處理→加入蛋白酶→保溫酶解→調(diào)節(jié)pH→沸水浴滅酶→離心分離→蛋白水解液

操作要點：用蒸餾水配制濃度為4%的螺旋藻粉液，調(diào)節(jié)pH為8.5，超聲波預處理20 min[21]，按每克蛋白加入4 000 U蛋白酶，添加蛋白酶液。混勻后置于45 ℃水浴中保溫酶解4 h，期間通過滴加1 mol/L的NaOH溶液來維持酶解體系pH的穩(wěn)定。酶解結(jié)束后調(diào)節(jié)酶解液的pH到4.0，然后將酶解液置于沸水浴滅酶10 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，定容后測定水解液的多肽濃度。

1.2.2 測定方法

試驗中所用蛋白酶的活力標定：采用Folin-酚法[22]。

樣品中蛋白濃度的測定：采用凱氏定氮法[23]。

樣品中多肽濃度的測定：采用肽含量測定的國標方法[24]。

水解液中多肽得率的計算：

多肽得率=水解液中肽的總量/水解液中原料蛋白質(zhì)總量×100%

1.2.3 多肽的氨基酸組成分析

參考修改后的國標檢測方法[25]。取水解液樣品2 mL，加入等體積濃度2 mol/L的三氯乙酸溶液，充分混合后在室溫靜置10 min；然后在8 000 r/min的條件下離心10 min。取一定量上清液經(jīng)酸完全水解處理后利用氨基酸自動分析儀測定樣液中各氨基酸的含量。

1.2.4 不同蛋白酶水解效果的比較

按照1.2.1所述方法，分別采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、微生物堿性蛋白酶、微生物中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶、桔青霉蛋白酶，在各蛋白酶適宜的條件下進行螺旋藻酶解實驗[26]，通過測定各水解液的多肽得率來比較不同蛋白酶對螺旋藻水解性能的差異，并由此確定適合螺旋藻水解的主要蛋白酶類型。

1.2.5 蛋白酶的復配

分別以胰蛋白酶(或微生物堿性蛋白酶)作為主酶，分別與微生物堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、微生物中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶、桔青霉蛋白酶按酶活比1∶1配制復合蛋白酶液；按照1.2.1所述方法進行螺旋藻酶解實驗,測定各水解液的多肽得率，比較不同復合蛋白酶對螺旋藻水解性能的差異，以及各蛋白酶之間的協(xié)同作用效果，并由此確定適合螺旋藻水解的復合蛋白酶組成。

1.2.6 蛋白酶復配比例的優(yōu)選

根據(jù)單酶及復合酶水解實驗的結(jié)果，確定了以微生物堿性蛋白酶與胰蛋白酶作為水解螺旋藻的主酶，木瓜蛋白酶作為輔助蛋白酶。設計胰蛋白酶與堿性蛋白酶以及主酶與輔助蛋白酶之間以不同的比例進行復配配制復合蛋白酶，然后按照1.2.1所述方法進行螺旋藻酶解實驗,測定各水解液的多肽得率，比較不同復合蛋白酶對螺旋藻水解性能的差異，由此確定適合螺旋藻水解的最佳復合蛋白酶組成。

1.2.7 螺旋藻酶解工藝的單因素實驗1.2.7.1 螺旋藻濃度對酶解工藝的影響

分別配制濃度為10、20、30、40、50、60、70、80 g/L的螺旋藻粉液，采用優(yōu)化后的復合蛋白酶按照1.2.1所述方法進行酶解實驗，測定各水解液的多肽得率，考察螺旋藻濃度對酶解工藝的影響。

1.2.7.2 蛋白酶用量對酶解工藝的影響

采用優(yōu)化后的復合蛋白酶，分別以1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、8 000 U/g的添加量，按照1.2.1所述方法進行酶解實驗，測定各水解液的多肽得率，考察蛋白酶用量對酶解工藝的影響。

1.2.7.3 酶解時間對酶解工藝的影響

采用優(yōu)化后的復合蛋白酶按照1.2.1所述方法進行酶解試驗，控制酶解時間分別為0.5、1、2、3、4、5、6 h，測定不同酶解時間所得水解液的多肽得率，考察酶解時間對酶解工藝的影響。

1.2.7.4 pH對酶解工藝的影響

采用優(yōu)化后的復合蛋白酶，按照1.2.1所述方法分別在pH 6、7、8、9、10、11、12的條件下進行酶解實驗，測定各水解液的多肽得率，考察pH對酶解工藝的影響。

1.2.7.5 溫度對酶解工藝的影響

采用優(yōu)化后的復合蛋白酶，按照1.2.1所述方法分別在30、35、40、45、50、55、60 ℃的溫度下進行酶解實驗，測定各水解液的多肽得率，考察溫度對酶解工藝的影響。

1.2.8 響應面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定出對螺旋藻酶解工藝有較顯著影響的三個因素：酶用量、酶解溫度及酶解時間。運用Design Expert軟件的Box-Behnken試驗設計(各因素及水平取值如表1所示)對上述三個因素做進一步分析， 并由此確定各因素的最佳取值。

表1 響應面實驗的因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選

比較了不同蛋白酶對螺旋藻水解效果的差異，試驗結(jié)果如表2所示。

表2 不同蛋白酶對螺旋藻水解效果的比較

注:表中標注不同小寫字母表示試驗結(jié)果之間有顯著性差異(P<0.05)，標注相同字母表示實驗結(jié)果之間無顯著性差異(P>0.05)，余同。

由表2可知，不同蛋白酶對螺旋藻的水解效率存在著較明顯的差異，在實驗的8種蛋白酶中，堿性蛋白酶和胰蛋白酶對螺旋藻的水解效率最高，而中性蛋白酶的水解效率較低，胃蛋白酶的水解效率最低。根據(jù)實驗結(jié)果初步確定了以微生物堿性蛋白酶或胰蛋白酶作為水解螺旋藻的主酶。

2.2 蛋白酶復配

分別以微生物堿性蛋白酶或胰蛋白酶為主酶與其他蛋白酶構(gòu)成復合蛋白酶，考察了不同復合蛋白酶對螺旋藻水解效果的差異，結(jié)果如表3所示。

由表3的試驗結(jié)果可以看出，微生物堿性蛋白酶或胰蛋白酶與其他幾種蛋白酶構(gòu)成的復合蛋白酶對螺旋藻的水解效果優(yōu)于表2中單一蛋白酶的實驗結(jié)果，由此說明試驗的幾種蛋白酶與微生物堿性蛋白酶(或胰蛋白酶)之間存在較顯著的協(xié)同作用效果。其中，微生物堿性蛋白酶、胰蛋白酶及木瓜蛋白酶三者之間表現(xiàn)出強的協(xié)同作用效果；而微生物堿性蛋白酶與桔青霉蛋白酶之間，胰蛋白酶與桔青霉蛋白酶和米曲霉蛋白酶之間有弱的協(xié)同作用效果。 通過上述試驗確定了以微生物堿性蛋白酶、胰蛋白酶及木瓜蛋白酶三者構(gòu)建復合蛋白酶，其中微生物堿性蛋白酶與胰蛋白酶作為復合蛋白酶的主酶，木瓜蛋白酶作為輔助蛋白酶成分。

表3 不同復合蛋白酶對螺旋藻水解效果的比較

2.3 蛋白酶復配比例的優(yōu)選

考察了微生物堿性蛋白酶與胰蛋白酶兩者的配伍比例及主酶與輔助酶之間的比例對螺旋藻水解效果的影響，結(jié)果如表4所示。

表4 蛋白酶復配比例對螺旋藻水解效果的影響

由表4可以看出，復合蛋白酶中三種成分的配伍比例對螺旋藻的水解效率有較顯著的影響，這進一步說明三種蛋白酶成分在螺旋藻水解過程中所取作用存在一定的差異：主酶中微生物堿性蛋白酶起主導作用，適當加大堿性蛋白酶的比例可顯著提高主酶對螺旋藻的水解效率，主酶中微生物堿性蛋白酶與胰蛋白酶的最佳復配比例為2∶1。在確定主酶配伍比例的前提下考察了木瓜蛋白酶添加比例對螺旋藻水解效果的影響。結(jié)果顯示，在主酶中輔助添加適量的木瓜蛋白酶可以顯著提高復合蛋白酶對螺旋藻的水解效率，主輔酶的適宜配伍比例為3∶1。綜合以上實驗結(jié)果最終確定了水解螺旋藻的最佳蛋白酶是由微生物堿性蛋白酶、胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按照2∶1∶1比例配制而成的復合蛋白酶。

2.4 酶解工藝的單因素實驗

2.4.1 底物濃度對螺旋藻酶解工藝的影響

從圖1可以看出，隨著螺旋藻濃度的增加，水解液中多肽得率呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢，尤其是當螺旋藻濃度超過50 g/L，多肽得率下降趨勢更為顯著。這可能與螺旋藻蛋白從細胞內(nèi)溶出的擴散效應有關，因為隨著螺旋藻濃度的增加，溶液中蛋白濃度增加，螺旋藻胞內(nèi)蛋白的溶出速率因此會減慢，胞內(nèi)蛋白殘留量則增加，使得有效底物蛋白量減少了；隨著蛋白濃度的增加，酶解體系中多肽濃度會隨之增加，多肽對蛋白酶的反饋抑制作用增強，水解體系中有效酶活降低；此外，隨著螺旋藻濃度的增加，酶解體系的黏稠度會迅速上升，這導致蛋白質(zhì)分子運動能力下降，酶與底物蛋白的結(jié)合效率降低，因此降低了蛋白酶的水解速率。根據(jù)上述實驗結(jié)果可確定螺旋藻的最大適宜濃度為50 g/L。

圖1 底物濃度對螺旋藻酶解工藝的影響

2.4.2 酶用量對螺旋藻酶解工藝的影響

由圖2可知，隨水解體系中酶用量的增加，多肽得率呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢，說明了體系中螺旋藻蛋白的水解程度在不斷提高；當酶用量增加到5 000 U/g以上時，多肽得率逐漸趨于穩(wěn)定，說明體系中酶量相對與底物蛋白已達到飽和，此時再進一步增加酶用量的效果不顯著。根據(jù)試驗結(jié)果初步確定酶解體系中復合蛋白酶的添加量在5 000 U/g左右。

圖2 酶用量對螺旋藻酶解工藝的影響

2.4.3 溫度對螺旋藻酶解工藝的影響

如圖3所示，溫度對螺旋藻多肽得率的影響呈現(xiàn)出典型的“鐘罩型”變化趨勢：當溫度低于50 ℃時，酶解體系的多肽得率隨溫度的升高而迅速增加，說明螺旋藻蛋白的水解程度在不斷提高，這是由于在一定范圍內(nèi)的升溫可以有效地提高酶促反應速度，同時有助于螺旋藻胞內(nèi)蛋白的溶出，提高了酶與底物蛋白的結(jié)合機率及水解效率。當酶解體系的溫度超過55 ℃，多肽得率會隨著溫度的升高而呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于較高的溫度導致了蛋白酶的部分變性失活；另外，高溫導致了螺旋藻蛋白變性而使其水溶性下降，這不利于螺旋藻蛋白從細胞內(nèi)溶出，以及與蛋白酶的結(jié)合，因此螺旋藻的水解效率呈現(xiàn)出下降的趨勢。從實驗結(jié)果來看，螺旋藻蛋白較適宜的酶解溫度在50 ℃左右。

圖3 酶解溫度對酶解工藝的影響

2.4.4 pH對螺旋藻酶解工藝的影響

從圖4可知，當酶解體系的pH在小于8.0的范圍時，多肽得率隨pH增加而顯著上升；當體系的pH超過10.0時，多肽得率隨pH增加而下降。這說明適度的堿性環(huán)境有利于螺旋藻蛋白的水解，這是由于構(gòu)成復合蛋白酶的3種酶都是在偏堿性的條件下有較高的酶活；此外，螺旋藻蛋白在酸性環(huán)境中溶解性能較差，堿性的溶劑環(huán)境有助于螺旋藻蛋白從細胞內(nèi)的溶出。根據(jù)以上實驗結(jié)果可以確定復合蛋白酶水解螺旋藻的最適pH在9.0左右。

圖4 pH對螺旋藻酶解工藝的影響

2.4.5 時間對螺旋藻酶解工藝的影響

從圖5可知，酶解過程呈現(xiàn)典型的速率衰減變化規(guī)律，在實驗初期(0～3 h)，酶解反應速度最快，表現(xiàn)為產(chǎn)物迅速積累，多肽得率快速上升。這是因為在此階段螺旋藻細胞內(nèi)外蛋白濃度差最大，螺旋藻蛋白從胞內(nèi)擴散到胞外的速度最快，蛋白酶的活性最強，此時水解體系的反應速度最快；在實驗中期(3～5 h)，酶解反應速度趨于平緩，表現(xiàn)為產(chǎn)物量增加較緩慢。這是由于螺旋藻細胞內(nèi)外蛋白濃度差已大幅度降低，胞內(nèi)蛋白的溶出速率減慢，溶液中可被水解的底物蛋白濃度大幅下降，前期積累的產(chǎn)物多肽已顯示出對蛋白酶的反饋抑制效果，使得蛋白酶的活性被削弱，因此酶解體系的反應速度逐漸減慢；在試驗后期(5～8 h)，酶解反應逐漸趨于停滯，產(chǎn)物量趨于穩(wěn)定，顯示酶解反應基本結(jié)束。根據(jù)實驗結(jié)果可初步確定螺旋藻的酶解時間在5 h左右。

圖5 酶解時間對螺旋藻酶解工藝的影響

2.5 酶解工藝的響應面實驗

通過以上單因素實驗初步確定了對螺旋藻酶解工藝有顯著影響的三個因素：加酶量、溫度和酶解時間。在固定螺旋藻濃度50 g/L，pH 9.0的前提下對這三個因素進行響應面優(yōu)化實驗，響應面實驗設計及結(jié)果見表5。

表5 響應面實驗設計與結(jié)果

對表5中的實驗結(jié)果進行回歸分析，得到了多肽得率(Y)相對于酶用量(A)、酶解溫度(B)和酶解時間(C)的數(shù)學模型(因素采用編碼值)：

Y=72.97+4.98A-6.46B+2.69C+1.54AB-2.43AC-1.25BC-0.33A2-9.41B2-2.74C2

對上述回歸模型及表5中數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果(見表6)顯示：以上擬合得到的回歸模型具有非常高的顯著性(P<0.01)，失擬項不顯著(P=0.088 5>0.05)，這說明以上模型對因素取值范圍內(nèi)的實驗結(jié)果有非常高的擬合度；模型的R2值為0.974 7，說明模型的預測值可以解釋97.47%的實驗結(jié)果；顯著性分析的結(jié)果顯示：在各因素的取值范圍內(nèi)，因素A、B、C對螺旋藻酶解工藝有極顯著的影響；此外，因素A和C之間有極顯著的交互作用(P<0.01)，因素A和B之間也有顯著的交互作用(P<0.05)。

表6 響應面實驗結(jié)果的方差分析

圖6、圖7 、圖8為以上模型所對應的響應曲面圖，從外形可以清晰看出擬合的響應面是典型的凸曲面，其所對應的等高線圖呈現(xiàn)向內(nèi)收縮數(shù)值遞增的變化趨勢，其中心點即有最大響應值。運用Design Expert10.0軟件的優(yōu)化算法可確定出該最大響應值為78.29%，此時各因素對應的取值分別為：加酶量6 000 U/g，溫度52 ℃，酶解時間6.2 h。

綜合以上單因素及響應面優(yōu)化的實驗結(jié)果可確定螺旋藻酶解的最佳工藝條件為：螺旋藻濃度50 g/L，pH 9.0，加酶量6 000 U/g蛋白，溫度52 ℃，酶解時間6.2 h。在優(yōu)化的工藝條件下進行螺旋藻酶解實驗，6次獨立試驗的平均結(jié)果為(77.82±1.21)%，這與模型的預測值基本一致，進一步驗證了上述模型的可靠性。實驗結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的復合蛋白酶可實現(xiàn)螺旋藻蛋白的高效水解，酶解工藝的多肽得率遠高于前述單一蛋白酶的結(jié)果，并顯著高于已有類似文獻報道的結(jié)果[27,28]，初步說明本酶解工藝具有可行性。

圖6 酶用量與溫度對螺旋藻酶解工藝的影響

圖7 酶用量與時間對螺旋藻酶解工藝的影響

圖8 溫度與時間對螺旋藻酶解工藝的影響

2.6 多肽的氨基酸組成分析

對螺旋藻粉及水解液中多肽的氨基酸組成進行了分析，結(jié)果如表5所示。

螺旋藻蛋白具有非常高的營養(yǎng)價值，其含有人體所需的17種氨基酸(因檢測條件限制沒能檢測色氨酸)，8種必需氨基酸占到蛋白總量的39%以上，尤其是其中的蛋氨酸及胱氨酸含量顯著高于植物源蛋白。比較螺旋藻蛋白與水解液多肽的氨基酸組成可以看出：水解螺旋藻所制備的多肽基本上保持了原螺旋藻蛋白的氨基酸組成，未出現(xiàn)氨基酸嚴重缺失情況；多肽中8種必需氨基酸占到氨基酸總量的43%以上，蛋氨酸含量豐富。由此說明，經(jīng)水解螺旋藻制備得到的多肽具有非常高的營養(yǎng)價值。

表7 螺旋藻及水解液中多肽的氨基酸組成

3 結(jié)論

為提高螺旋藻蛋白資源的利用率，本研究考察了復合蛋白酶水解螺旋藻高效制備多肽的工藝路線。從復合蛋白酶的構(gòu)建入手，比較了不同蛋白酶對螺旋藻水解效果的差異。結(jié)果表明：微生物堿性蛋白酶和胰蛋白酶對螺旋藻蛋白有較好的適應性，水解效率較高，可作為水解螺旋藻的主酶；木瓜蛋白酶與微生物堿性蛋白酶、胰蛋白酶之間存在非常顯著的協(xié)同作用效果，與它們配伍可顯著提高復合蛋白酶的水解效率。因此，木瓜蛋白酶可作為復合蛋白酶的輔助酶成分。通過配伍比例的優(yōu)化確定了復合蛋白酶的最佳組成為：微生物堿性蛋白酶、胰蛋白酶與木瓜蛋白酶按照酶活比2∶1∶1的比例構(gòu)建復合蛋白酶。運用單因素及響應面實驗方法對螺旋藻的酶解工藝條件進行了優(yōu)化，最終確定了復合蛋白酶水解螺旋藻的最佳工藝條件為：螺旋藻濃度50 g/L，pH 9.0，加酶量6 000 U/g蛋白，溫度52 ℃，酶解時間6.2 h。在優(yōu)化的工藝條件下復合蛋白酶水解螺旋藻的多肽得率可以達到(77.82±1.21)%，結(jié)果顯示優(yōu)化后的復合蛋白酶可實現(xiàn)螺旋藻蛋白的高效水解。對水解液中多肽的氨基酸組成進行了分析，結(jié)果顯示：多肽具有與螺旋藻蛋白相近的氨基酸組成，氨基酸種類齊全，營養(yǎng)價值較高，8種必需氨基酸含量豐富，占到氨基酸總量的43%以上。結(jié)果表明，復合蛋白酶高效水解螺旋藻制備多肽的工藝具有可行性。