陳娟，劉琪，張定珍，韓素菊

（綿陽師范學(xué)院城鄉(xiāng)建設(shè)與規(guī)劃學(xué)院，四川綿陽 621000）

玉露（Haworthia cooperiBaker）屬于百合科十二卷屬軟葉品種，原產(chǎn)南非，現(xiàn)世界多地均有栽植。玉露因其透亮如露珠的外形很受歡迎，市場需求較大[1-2]。

玉露生長較為緩慢，產(chǎn)量少，個(gè)別稀有品種母本難求。玉露采用葉插、根、枝插、分株和種子等方式進(jìn)行繁殖，但均存在繁殖系數(shù)小、繁殖速度慢的問題，短時(shí)間內(nèi)難以滿足市場需要[3-4]。另外，玉露變異（嵌合體）品種稀少，只能通過雜交的方式獲得，概率低，數(shù)量少，價(jià)格昂貴。目前，關(guān)于玉露的組織培養(yǎng)快繁及變異的研究較少[5-7]。陳紅剛等[1]和宋揚(yáng)[6]以玉露花莖為外植體建立了組培快繁體系，但花莖取樣有時(shí)間限制，不如葉片方便。該研究以玉露葉片為試驗(yàn)材料，構(gòu)建了玉露組織培養(yǎng)快繁體系，并且利用不同濃度的誘變劑溴化乙錠誘導(dǎo)玉露變異體，旨在為實(shí)現(xiàn)玉露規(guī)?；a(chǎn)和進(jìn)一步的品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玉露組織培養(yǎng)體系建立

1.1.1 愈傷組織的誘導(dǎo)。取新鮮玉露葉片，置流水下沖洗約30 min 后，置于濃度為2%次氯酸鈉（NaClO）溶液中浸泡15 min，在超凈工作臺紫外光燈下消毒30 min，80%酒精消毒10 s 后接種。在酒精燈旁操作，剪刀、鑷子均在酒精燈火焰上灼燒后接種，接種時(shí)切除葉端，每瓶接種5 片玉露葉片。按照培養(yǎng)基中不同的激素濃度配比處理分為4 組，每組8 瓶。處理1 為：MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；處理2 為：MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；處理3 為：MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L；處理4 為：MS+6BA 0.4 mg/L+NAA 0.4 mg/L。接種好后置于2000 Lx 光照和溫度25℃下培養(yǎng)。觀察愈傷組織生長情況，記錄出愈時(shí)間及比例，確定最佳愈傷組織培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷組織大量分化時(shí)開始繼代，繼代培養(yǎng)基選用MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

1.1.2 愈傷組織的叢芽分化培養(yǎng)。愈傷組織叢芽分化培養(yǎng)基處理分為4 組，處理1 為：MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；處理2 為：MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；處理3 為：MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L；處理4 為：MS+6BA 0.4 mg/L+NAA 0.4 mg/L。每個(gè)處理為8 瓶，每瓶8 個(gè)愈傷組織塊。取繼代培養(yǎng)中生長良好的大小均勻的愈傷組織，在2000 Lx 光照和溫度25℃下培養(yǎng)。記錄出芽時(shí)間及生長狀況。

1.1.3 壯苗與生根培養(yǎng)。復(fù)壯生根培養(yǎng)基選用4 種不同激素配比。處理1：1/2MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；處理2 為：1/2MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；處理3 為1/2MS MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L；處理4 為：1/2MS MS+6BA 0.4 mg/L+NAA 0.4 mg/L。在超凈工作臺上，選用生長良好的叢芽，將剪刀和鑷子在酒精燈上灼燒冷卻后，切除叢芽基部，將叢芽插入培養(yǎng)基，在2000 Lx 光照和溫度25℃下培養(yǎng)。記錄生根時(shí)間及生長狀況。

1.1.4 出瓶與硬化。硬化基質(zhì)為泥炭土∶蛭石∶珍珠巖1∶1∶1 均勻混合，噴水使其濕潤。將組培苗栽入基質(zhì)，澆透水，置于陰涼通風(fēng)處，避免陽光直射。后期每10 d 澆水，注意通風(fēng)和適當(dāng)遮陰。

1.2 玉露誘變體系建立

1.2.1 玉露變異嵌合體誘導(dǎo)。誘導(dǎo)變異試驗(yàn)共分為4 組，每組24 瓶。以MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的溴化乙錠，其濃度梯度為：0、1、10 和100 mg/L。在4 種培養(yǎng)基中分別接種疏松且具有明顯叢芽分化趨勢的大小均勻的愈傷組織，置于2000 Lx 光照和溫度25℃下培養(yǎng)90 d，期間不斷繼代與分瓶。記錄嵌合體變異及生長狀況。將誘導(dǎo)出變異的愈傷組織接種在叢芽分化培養(yǎng)基MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L 中，使其分化成叢芽。

1.2.2 嵌合體變異強(qiáng)化。選取生長狀況良好的玉露嵌合體一代復(fù)壯生根叢苗，切下嵌合體變異明顯的葉片，盡量保持切口面積大和光滑，將葉片橫放在培養(yǎng)基MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L 中，傷口50%埋入培養(yǎng)基，50%露在空氣中，以利于愈傷組織的形成。待愈傷組織大量形成，將愈傷組織一部分繼代在MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，以得到更疏松的愈傷組織，一部分繼代在MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L，以促使其分化成苗。以嵌合體一代苗再次組培強(qiáng)化變異可得到嵌合體二代。

1.2.3 嵌合體變異苗的出瓶與硬化。出瓶過程中，硬化基質(zhì)采用泥炭土∶珍珠巖∶蛭石1∶1∶1。將組培苗栽入基質(zhì)中，置于陰涼通風(fēng)處，澆透水，避免陽光直射。后期每隔10 d 澆水，注意通風(fēng)和適度遮陰。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉露組培體系的構(gòu)建

2.1.1 激素濃度對玉露愈傷組織生成的影響。在組培過程中，葉片膨大形成透明體后開始形成愈傷組織，20 d 后在處理2 和處理3 的培養(yǎng)基上形成少量愈傷組織，30～40 d 開始大量形成愈傷組織。在60 d時(shí)接入的葉片在所有培養(yǎng)基上均達(dá)到60%以上的出愈率，其中處理2 培養(yǎng)基上出愈率最高，達(dá)到85%。從表1 和圖1a、b 可以看出，處理2 中的愈傷組織形成速度和出愈外植體數(shù)均顯著高于其他處理。其次是處理3，在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間均高于其他2 個(gè)處理。隨著培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素6-BA 和NAA 激素濃度的成倍增加，其對愈傷組織生成的促進(jìn)作用表現(xiàn)為先增強(qiáng)，后逐漸減弱趨勢，表明植物激素濃度超過一定的閾值范圍時(shí)，其增加并不能促進(jìn)愈傷組織生成。

2.1.2 不同激素配比處理對愈傷組織叢芽分化的影響。如表2 和圖1c、d 所示，不同激素濃度處理對玉露愈傷組織的叢芽生成率影響顯著，隨著時(shí)間的延長，出芽率呈上升趨勢。在40 d 時(shí)，有50%以上的愈傷組織分化成芽，其中處理2 培養(yǎng)基上的叢芽生成率最高，并且其出芽速度快，在20 d 時(shí)已有59%的愈傷組織分化成芽，在30 d 時(shí)有92%分化成芽，表明處理2 的激素濃度對于愈傷組織的增殖和叢芽的分化效果最明顯，為最佳激素配比。其余處理中，處理4 培養(yǎng)基中的叢芽生成率最低。

2.1.3 不同激素濃度配比對叢芽生根的影響。玉露叢生芽接入生根培養(yǎng)基后，1 周后能夠看見萌發(fā)的新根。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各處理的生根率逐步上升。如表3 和圖2 所示，處理1 的生根培養(yǎng)基上玉露生根快，生根率高，在25 d 時(shí)生根率為70%，在40 d時(shí)可達(dá)到97%。處理2 的培養(yǎng)基生根效果要優(yōu)于處理3 和處理4，40 d 處理2 上的培養(yǎng)基可達(dá)到59%。處理3、4 生根效果不良，兩者間無明顯差異。

2.2 玉露的變異誘導(dǎo)

高濃度的溴化乙錠對玉露愈傷組織的增殖與叢芽的分化有明顯的抑制作用。叢芽分化少、生根慢、根長勢差，甚至不長根。叢芽基部對溴化乙錠有較大的吸附作用。

表1 不同激素濃度處理對玉露愈傷組織生成的影響

表2 不同激素配比對玉露愈傷組織叢芽生成率的影響

圖1 處理2 愈傷組織叢芽分化情況

圖2 處理1 叢生芽分化成根情況

在溴化乙錠濃度為1 mg/L 培養(yǎng)基中得到嵌合體個(gè)體，在MS+6BA 0.2 mg /L +NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基中繼續(xù)繼代后產(chǎn)生大量的嵌合體叢芽（圖3、圖4a）。取嵌合體一代苗的葉片，再次組培形成嵌合體二代苗，以促進(jìn)形成大量嵌合體變異的愈傷組織和叢芽，嵌合體二代個(gè)體強(qiáng)化了嵌合體一代個(gè)體的變異（圖4b、c），并發(fā)現(xiàn)有少量無葉綠素的個(gè)體（圖4d）。

表3 不同激素配比對玉露叢芽生根的影響

圖3 MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基上嵌合體生長情況

圖4 嵌合體后代生長情況

3 討論和結(jié)論

與陳麗等[5]和張景新等[4]以葉片外植體建立的組培體系相比，該試驗(yàn)采用了不同的激素種類與濃度，但是獲得了較好的愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率和生根率。目前玉露誘導(dǎo)變異的研究較少，周海成等[7]采用冰燈玉露松散型胚性愈傷組織為誘變試材，在培養(yǎng)基中加入0.1%EMS 處理后獲得形態(tài)變異個(gè)體。該試驗(yàn)采用了不同的誘變劑，用低劑量的溴化乙錠誘導(dǎo)出可遺傳變異的嵌合體。誘導(dǎo)育種是園藝植物品種選育的途徑之一[8]。不同的誘導(dǎo)劑可能誘導(dǎo)出不同的形態(tài)變異。未來還可探討不同誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效應(yīng)，或者采用某些射線等物理誘導(dǎo)方法來進(jìn)行玉露品種選育。

該試驗(yàn)以玉露葉片為外植體構(gòu)建了組培快繁體系。確定的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和叢芽分化培養(yǎng)基為MS+6BA 0.2 mg/L +NAA 0.2 mg/L，壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。此外，在愈傷組織培養(yǎng)基中添加1 mg/L 溴化乙錠時(shí)，后代產(chǎn)生了生長良好的嵌合體變異品種。