王子璇 靳亞軍 張泗舉 欒維江

摘 ? ?要：水稻成花素家族基因在水稻的開花結(jié)實過程中發(fā)揮重要作用。水稻基因組中共有19個成花素相關(guān)基因，其中Hd3a和RFT1基因已被證實能夠促進水稻抽穗開花，其余成花素成員功能未知。本文針對水稻成花素家族成員OsDTH11基因，基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了基因編輯載體，并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功獲得了該基因的敲除突變體。經(jīng)測序驗證發(fā)現(xiàn)了2種類型的突變體，一種是純合的62 bp缺失突變體，另一種是31 bp缺失的雜合突變體。通過自交分離分別獲得兩種類型穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料，為OsDTH11基因的生物學功能與水稻開花分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻;突變體;OsDTH11;CRISPR/Cas9

中圖分類號：S511 ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.001

Abstract： The florigen family genes play an important role for the rice flowering. There are 19 members predicted in the rice genome. In these members， Hd3a and RFT1 were identified and characterized as florigen to promote rice flowering. The function of the rest of members remained unknown. In this study， we constructed the CRISPR/Cas9 editing vector of OsDTH11， a member of the florigen family gene， and introduced it into rice callus to produce the editing mutants by Agrobacterium-mediated transformation method. Further sequencing analysis confirmed that the obtained mutants had two types of mutation. One type of mutation was a homozygous 62 bp deletion in the editing mutant. The other was a heterozygous 31 bp deletion in the editing mutant. Finally， we obtained two kinds of homozygous mutants by self-fertilization， and these two kinds of mutation could stablely transmit to the next generation. These mutants laid a foundation for the functional study of OsDTH11 gene.

Key words： rice; mutant; OsDTH11; CRISPR/Cas9

水稻抽穗開花是水稻生產(chǎn)實踐中的重要農(nóng)藝性狀，對水稻產(chǎn)量有著重要影響。目前研究表明，水稻的抽穗開花受多種基因表達調(diào)控通路的共同影響，其中成花素基因家族在這一過程中扮演重要角色。成花素基因編碼的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP），是一類可溶性的小分子球狀蛋白，由中央較大的β-折疊和兩側(cè)較小的β-折疊及α-螺旋形成陰離子結(jié)合口袋，能夠識別和結(jié)合磷酸化氨基酸殘基，和磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolamine）結(jié)合[1-2]。PEBP蛋白分布廣泛，存在于從酵母到哺乳動物的多個物種中[3-5]。水稻基因組中共發(fā)現(xiàn)19個PEBP基因[1]，其中Hd3a及RFT1是兩個功能明確的水稻成花素基因，可以促進水稻的抽穗[6]。成花素Hd3a及RFT1首先在葉片中表達，然后長距離轉(zhuǎn)運到莖頂端分生組織后，在細胞質(zhì)中與其受體14-3-3蛋白結(jié)合，再轉(zhuǎn)入細胞核中與OsFD1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成成花素激活復合體（Florigen activation complex， FAC），誘導下游的花分生組織特異性基因OsMADS14及OsMADS15的表達，從而促進水稻的開花[6-7]。

創(chuàng)制突變體是基因功能研究的重要手段。傳統(tǒng)的突變體創(chuàng)制方法主要通過理化誘變、T-DNA片段插入、轉(zhuǎn)座子序列插入等方法。這些方法費時費功，不能定向產(chǎn)生某一確定基因的突變體材料。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對于基因組序列已知的物種，可針對某一特定的基因，創(chuàng)制相應的編輯突變體。目前基因編輯方法主要包括ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9，其中CRISPR/Cas9最為便捷高效[8]。CRISPR/Cas9的作用機制是由gRNA與Cas9蛋白組成復合體實現(xiàn)的，gRNA負責定位與其有互補關(guān)系的DNA雙鏈，Cas9蛋白負責切割DNA雙鏈產(chǎn)生雙鏈斷裂（Double strand breaking， DSB），經(jīng)非同源末端連接修復后，導致堿基的插入或缺失突變。由于CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡單，效率較高，目前已被廣泛地應用于各類生物中進行基因編輯。本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻成花素基因家族中未知功能基因OsDTH11（Date to heading 11， DTH11）進行敲除，產(chǎn)生功能缺失的突變體，并通過自交分離獲得穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料。本研究結(jié)果為水稻成花素基因的功能研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，以期全面揭示水稻成花素基因家族在開花分子調(diào)控中扮演的角色。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以粳稻品種中花11（Oryza sativa spp.japonica）為受體材料，經(jīng)過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，產(chǎn)生CRISPR/Cas9編輯突變體材料。

1.2 CRISPR/Cas9靶位點設(shè)計

從水稻基因組數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）獲得OsDTH11基因組序列和編碼序列。利用CRISPR/Cas9靶位點在線設(shè)計平臺http：//skl.scau.edu.cn/[9]，設(shè)計靶位點。設(shè)計原則為：從目的基因的CDS序列中，查找符合GN19NGG的序列。其中GN19為20個堿基的靶點序列，NGG（N表示任意堿基）為識別靶序列的原初間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif， PAM）。優(yōu)選靶位點位于編碼序列5端，GC含量大于50%，且與潛在脫靶位點的差異至少在3個堿基以上，以保證編輯的特異性，避免產(chǎn)生脫靶效應。

1.3 CRISPR/Cas9表達載體的構(gòu)建

具體分為gRNA表達載體與CRISPR/Cas9-gRNA表達載體的構(gòu)建兩個步驟。第一步是構(gòu)建gRNA的表達載體。（1）將靶點加上接頭序列，合成兩條24 nt的引物T-F和T-R。將引物T-F和引物T-R溶解，終濃度為10 μmol·L-1，各取10 μL加到PCR管，PCR儀中95 ℃孵育10 min，緩慢降至室溫，獲得寡聚二聚體。（2）用非典型Ⅱ型核糖核酸內(nèi)切酶BbsⅠ切割空載體pOsU6SK，回收載體骨架。（3）將獲得寡聚二聚體與回收的pOsU6SK載體骨架，用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴鍋中過夜連接。（4）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑選單克隆進行PCR驗證及測序分析，獲得含有靶點的gRNA表達載體pOsU6SK-T1/T2。

第二步是構(gòu)建最終能在植物中表達的雙元載體。（1）用KpnⅠ和Hind III酶切第一步構(gòu)建好的pOsU6SK-T1/T2質(zhì)粒，回收gRNA表達盒;接著用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切含有Cas9片段的pCas9SK質(zhì)粒，回收Cas9的表達盒;然后用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切pCAMBIA1300雙元載體，回收載體骨架。（2）將回收的3個片段用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴鍋中過夜連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選單克隆進行PCR驗證及酶切驗證，獲得最終可以轉(zhuǎn)化水稻的雙元重組表達載體。

1.4 目的基因編輯突變體的獲得與分子鑒定

將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9-gRNA表達載體電擊轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株EHA105中，采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入水稻的愈傷組織中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，具體操作方法參考Hiei等[10]論文中所述。將獲得的轉(zhuǎn)基因植株移栽至試驗田中種植，植株復壯后采集單株葉片，用CTAB法提取基因組DNA作為模版，用載體中抗性標記基因潮霉素檢測轉(zhuǎn)基因植株，判斷所構(gòu)建的載體是否轉(zhuǎn)入到水稻中。PCR擴增引物為Hyg-F（5-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3）和Hyg-R（5-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3）。擴增條件為： 94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，運行30次循環(huán);72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。

1.5 編輯突變體的突變位點測序分析

參照OsDTH11基因的基因組序列，分別在靶點的上下游約250 bp處設(shè)計一對檢測引物，對包含了靶點的區(qū)段進行PCR擴增，分析目的基因OsDTH11的突變位點與類型。所用引物序列為OsDTH11-C-F（5-GCACTGGAATGACGTAGCAC-3）和OsDTH11-

C-R（5-TAAGTACTCTCTCAACGTCG-3），擴增條件為： 94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，運行30次循環(huán);72 ℃延伸7 min。最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物先進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測擴增產(chǎn)物質(zhì)量及片段大小，然后將擴增產(chǎn)物進行測序。對出現(xiàn)編輯的測序結(jié)果，用雙鏈解碼工具http：//dsdecode.scgene.com或者http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/進行解碼分析。對自交后代純合突變體的鑒定采用相同的引物和方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶位點的選擇

水稻OsDTH11基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。OsDTH11包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼序列總長度為543 bp，編碼180個氨基酸。根據(jù)靶點設(shè)計原則以及OsDTH11基因結(jié)構(gòu)特點，在第1個外顯子上設(shè)計了T1（5-GTCGGCGAACAGCCTGGTGC-3）和T2（5-GTTCTCGCCGGAGGTGACGC-3）2個靶點。通過BLAST比對分析顯示，2個靶點特異性好，潛在脫靶率低。

2.2 目的基因CRISPR/Cas9表達載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9在植物中的表達載體的骨架是pCAMBIA1300，表達載體需要裝載gRNA與Cas9表達盒。首先將靶點序列T1和T2裝載到gRNA的表達載體pOsU6SK上，用M13F和T-R引物對進行菌斑PCR擴增，得到372 bp的目的條帶（圖2A）;提取質(zhì)粒后，用KpnⅠ和Hind III酶切驗證，得到475 bp的gRNA表達盒（圖2B），說明T1及T2靶點已成功裝載到pOsU6SK載體中，后經(jīng)測序證明兩個靶點裝載正確。

將上述構(gòu)建的重組載體用KpnⅠ和Hind III酶切回收gRNA表達盒，再將Cas9的表達盒從p35S-Cas9-Nos-SK載體上用Hind III和EcoRⅠ雙酶切回收，同時將植物雙元載體pCAMBIA1300骨架用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切回收。將上述3個回收后片段用瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2C），用T4 DNA連接酶將3個片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞得到最終的表達載體，挑取單克隆進行酶切驗證，目的條帶大小符合預期（圖2D），表明帶有靶點的gRNA及Cas9表達盒都成功連入植物雙元載體pCAMBIA1300中，獲得了最終的CRISPR/Cas9重組載體。

2.3 編輯突變體的獲得和分子鑒定

將含有T1靶點的重組載體pCAMBIA1300-Cas9-T1和含有T2靶點的重組載體pCAMBAI1300-Cas9-T2，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，侵染水稻品種中花11的愈傷組織。在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，挑選生長緊實，顏色黃亮的愈傷顆粒移入分化培養(yǎng)基誘導分化。分化出的小苗經(jīng)生根誘導后，得到T0代轉(zhuǎn)基因植株。本研究共獲得了T1靶點CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化的17個獨立株系的基因編輯植株，未知原因未獲得T2靶點的基因編輯植株。提取17株基因編輯植株的基因組DNA作為PCR擴增模板，用潮霉素抗性篩選標記基因引物Hyg-F和Hyg-R進行PCR擴增檢測。結(jié)果表明，獲得的17株基因編輯植株均為潮霉素抗性基因陽性植株（圖3）。

2.4 編輯突變體鑒定與測序分析

為了驗證轉(zhuǎn)基因陽性植株的靶位點是否發(fā)生了編輯突變，對所有的17株T0代轉(zhuǎn)基因植株進行了靶位點測序分析，按預期設(shè)計，PCR擴增片段長度為605 bp。測序結(jié)果表明，17株T1靶點的轉(zhuǎn)基因植株中有2株在靶點位置的序列發(fā)生了變異，將2株突變體分別命名為m1、m2。突變體m1在進行PCR擴增時，擴增產(chǎn)物長度比預期設(shè)計的片段?。▓D4A）。經(jīng)測序分析為純合大片段缺失，兩條同源染色體均從T1靶點開始進行編輯，缺失了64 bp（圖4A）。突變體m2經(jīng)測序出現(xiàn)疊峰，經(jīng)解碼分析為雜合突變，一條同源染色體缺失31 bp片段，另一條同源染色體與野生型序列一致（圖4B）。

為了驗證T0代m1及m2突變體是否確為純合突變體和雜合的突變體，并獲得m2突變體的純合編輯突變體，我們收獲了T0代突變體的種子，種植在試驗田中，獲得了T1代的植株。對T1代單株測序檢測表明：m1突變體T1代植株全部為大片段缺失突變，沒有分離，可以穩(wěn)定遺傳，說明其的確為純合突變體。m2突變體T1代植株經(jīng)PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生了基因型分離。20株T1代植株中6株（2、5、10、13、15、17）為純合31 bp缺失，6株（8、9、11、14、16、20）擴增出了預期的605 bp和574 bp的兩條帶，仍為雜合突變，其余8株為野生型植株，只擴增出了605 bp的目的條帶（圖4C），說明T0代m2突變體的確是雜合突變，通過自交分離出純合的編輯突變體，而且可以穩(wěn)定遺傳到下一代。

進一步分析突變體在氨基酸序列上的變化，發(fā)現(xiàn)m1突變體缺少起始密碼子，無法正常開始翻譯蛋白質(zhì)。m2純合突變體由于缺失31 bp片段導致移碼突變，翻譯至第15個密碼子時出現(xiàn)終止密碼子，翻譯提前終止。

綜上，我們通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功的敲除了成花素家族成員OsDTH11基因，產(chǎn)生了兩種類型的突變體。兩種類型的突變體都可能導致OsDTH11基因的功能缺失，為進一步研究OsDTH11基因的功能提供了材料。后續(xù)針對純合突變體材料的表型分析將進一步揭示OsDTH11基因的生物學功能。

3 結(jié)論與討論

PEBP家族廣泛存在于擬南芥、水稻、小麥、玉米、楊樹、番茄、大豆等高等植物中。對這些物種PEBP家族成員的氨基酸序列聚類分析，可以明顯的分成FT-like、TFL-like和MFT-like三個亞家族[11]。這3個亞家族的功能已有了分化。如擬南芥的FT和TFL1、水稻的Hd3a及RCN、番茄的SP和SFT基因兩兩功能相反，分別為擬南芥、水稻及番茄的成花素和反成花素，促進或抑制植物開花[12-14]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，過量表達OsFTL10可以增加水稻的耐旱性，表明PEBP家族存在花期調(diào)控以外的其他生長發(fā)育功能[15]，因而對其他成員的研究有著重要的意義。

為了解析OsDTH11的功能，本研究設(shè)計了T1和T2兩個靶點，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行突變體的創(chuàng)制，共獲得了T1靶點CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化的17株T0代轉(zhuǎn)基因植株。測序分析表明，有2個轉(zhuǎn)基因植株的靶位點區(qū)段發(fā)生突變，突變率為12%，和以前報道的基因編輯效率相似?；蚓庉嫷男屎皖愋?，跟表達載體的效率、靶點的序列、靶基因在染色體上的位置、T-DNA整合到染色體上的位置等緊密相關(guān)。Ma等[17]研究表明，靶點序列與gRNA的骨架如果形成連續(xù)7個以上堿基對的互補，會嚴重影響打靶的效率。因此，不同的基因或選擇的不同的靶點，編輯效率會有所不同。CRISPR/Cas9所導致的突變類型，一般是位于PAM前4～8 bp處發(fā)生數(shù)個堿基的缺失或插入，不同靶點的突變效率也有差異[16]，本研究中獲得了兩個不同大片段缺失類型，通過自交并進行測序分析發(fā)現(xiàn)這兩個突變體都可以穩(wěn)定遺傳。本研究獲得的兩種基因編輯突變株均阻礙蛋白質(zhì)的正常翻譯，導致OsDTH11基因功能的喪失，為進一步揭示其生物學功能提供了可靠的突變體材料。

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