李靜 王建紅 張伊帆 王樹偉

摘要?從自然染菌死亡的蚜蟲體內(nèi)分離得到一種殺蚜真菌，經(jīng)鑒定為寄生曲霉（Aspergillus parasiticus），具有感染流行性，相對濕度75%以上，對蚜蟲的侵染率達(dá)95%以上，對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，接種量為2.5%（重量比），玉米面和麩皮比例1∶1，水分含量60%，28 ℃，相對濕度80%，培養(yǎng)時間72 h ，產(chǎn)孢量最高達(dá)3.0×109 CFU/g;該株殺蚜真菌對蚜蟲持效期達(dá)15 d以上，明顯優(yōu)于10%吡蟲啉和40%毒死蜱防治效果。

關(guān)鍵詞?蚜蟲;生防;寄生曲霉;分離;防效

中圖分類號?S433.39文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0142-04

Abstract?An killing fungus was isolated from aphids that died from natural infection.It was identified as Aspergillus parasitus of aphid fungus，which had infection prevalence.When the relative humidity was above 75%，the infection rate of aphid was above 95%.By optimizing the culture conditions，the test results showed that the inoculation amount was 2.5% （according to the weight ratio of liquid seeds and solid materials）; corn flour and bran ratio was 1∶1，moisture 60%，28 ℃，relative humidity 80%，72 h，the quantity of spore was 3.0×109CFU/g;the effort on aphid was more than 15 days，which was obviously better than the control effect of 10% Imidacloprid and 40% Chlorpyrifos.

Key words?Aphid;Biocontrol;Aspergillus parasiticus;Isolation;Control effect

目前已發(fā)現(xiàn)的蚜蟲約4 400種，共有10個科 [1]，蚜蟲具有種類多、數(shù)量大、繁殖快、世代重疊、危害大、分布廣、寄主雜等特點(diǎn)。以尖利的口器刺吸植物汁液，引起植物生長率降低，出現(xiàn)葉斑、泛黃、卷葉、枯萎等甚至死亡。據(jù)統(tǒng)計，2010—2011年我國26萬hm2小麥中，有62.5%遭受了蚜蟲的嚴(yán)重危害，尤其是麥長管蚜，造成華北平原、長江中游等地區(qū)小麥產(chǎn)量下降15%～60%[2]。蚜蟲以群居方式吸取植株的養(yǎng)分且傳播病毒病，間接危害嚴(yán)重，目前已知病毒的昆蟲傳播介體有600種，其中275種屬于蚜蟲，居世界傳病毒昆蟲之首，如桃蚜（Myzus persicae）是超過110種植物病毒的載體[3]。由于蚜蟲危害嚴(yán)重，其防治措施的研究一直是植物保護(hù)研究工作的重大課題。

蚜蟲的防治技術(shù)可分為化學(xué)防治、物理防治以及生物防治，化學(xué)防治仍是防治蚜蟲的主要手段?；瘜W(xué)方法防治蚜蟲效果顯著且使用方便，但會污染環(huán)境，破壞生態(tài)系統(tǒng)。物理方法防治蚜蟲具有不產(chǎn)生抗性、無殘留、對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，還能較快降低蚜蟲數(shù)量，可充分發(fā)揮天敵自然控蚜的能力。近年來，蚜蟲生物防治技術(shù)受到廣大學(xué)者的普遍關(guān)注，包括天敵、生防菌、植物源農(nóng)藥等[4-5]。

高效、安全、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性的防治蚜蟲微生物農(nóng)藥的開發(fā)及應(yīng)用，已是各國植保工作者的研究重點(diǎn)。真菌、細(xì)菌、病毒等蚜蟲病原性微生物也可廣泛用于防治蚜蟲，如白僵菌、綠僵菌、蠟蚧輪枝菌、菊歐文氏桿菌，禾谷縊管蚜病毒（RhPV）、鏈霉菌等病原微生物對蚜蟲的防治均取得了顯著效果[6-7]。昆蟲病原真菌有顯著的流行性及方便生產(chǎn)的特性[8-9]。筆者從自然染菌死亡的蚜蟲體內(nèi)分離出殺蚜真菌寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）并探索其最優(yōu)培養(yǎng)條件，以期擴(kuò)充殺蚜真菌的資源庫、提高蚜蟲生防真菌殺蚜廣譜性，為開發(fā)新型殺蚜微生物農(nóng)藥提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?菌株來源

菌株來源于河南省鄭州市徳谷元有機(jī)生態(tài)園區(qū)3號地塊種植的蘿卜葉片上發(fā)現(xiàn)染菌死亡的蚜蟲，2016年11月12日09：30用無菌的塑料管采集感染蚜蟲，密封后，常溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，-20 ℃進(jìn)行保存。

1.2?殺蚜菌株的篩選

1.2.1?培養(yǎng)基。PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 15～20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0。PDA液體培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2.2?殺蚜菌株的分離純化。

將采集的染菌死亡蚜蟲，經(jīng)75%乙醇浸泡30 min，用無菌蒸餾水清洗干凈，PDA平板中加入20 μL Amp，直接將蟲體放置于PDA固體平板中，于28 ℃培養(yǎng)72 h。

1.2.3?殺蚜菌株液體發(fā)酵。

在250 mL三角瓶中裝入150 mL PDA液體培養(yǎng)基，121 ℃、0.15 MPa下滅菌30 min。將獲得的純種3號殺蚜菌株孢子接入滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)24 h，得到殺蚜真菌的液體菌絲。

1.3?殺蚜真菌的固體發(fā)酵優(yōu)化

設(shè)置不同碳氮比的固體物料進(jìn)行固體發(fā)酵[10]，麩皮與玉米面（重量比）按照1∶1、1∶2、1∶3進(jìn)行配比;水分按照55%、60%進(jìn)行組合（表1），將液體發(fā)酵菌絲轉(zhuǎn)接至經(jīng)121 ℃滅菌60 min的固體發(fā)酵料上，28 ℃培養(yǎng)72 h，相對濕度75%以上。產(chǎn)生孢子后，經(jīng)3 d自然風(fēng)干，粉碎后獲得殺蚜菌株的固體孢子粉，通過PDA平板活菌計數(shù)來確定最優(yōu)的發(fā)酵組合[11-12]。

1.4?蚜蟲防效測定

試驗(yàn)1：在鄭州市中牟縣德谷園蔬菜大棚內(nèi)，供試作物品種是小西葫蘆，選定被蚜蟲寄生的區(qū)域。殺蚜菌株孢子粉與水稀釋比按照1∶500、1∶750、1∶1 000倍稀釋，并設(shè)置清水空白對照。每個試驗(yàn)處理小區(qū)面積15 m2，重復(fù)3次試驗(yàn)，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，采用背負(fù)式手動噴霧器噴霧，噴液量為600 kg/hm2，于傍晚前噴霧并保證棚內(nèi)相對濕度≥85%。為了防止處理間相互干擾，施藥時用塑料膜遮隔相鄰小區(qū)。處理前在小區(qū)內(nèi)5點(diǎn)取樣，每個點(diǎn)選2株植株，并在選定植株上標(biāo)定3片無翅成蚜寄生量不少于50頭的葉片，調(diào)查蟲口基數(shù)，于處理后3、5、7 d統(tǒng)計蚜蟲數(shù)量，計算防治效果，具體計算公式：

蟲口減退率=（處理前蟲口基數(shù)-處理后各天殘留蟲數(shù)）/處理前蟲口基數(shù)×100%[13]

防治效果=（處理區(qū)蟲口減退率-對照區(qū)蟲口減退率）/（100-對照區(qū)蟲口減退率）×100%[14]

試驗(yàn)2：在河南安陽棉花基地，供試作物品種是棉花蚜蟲。殺蚜菌株與水稀釋比按照1：750倍稀釋（作為A組），以清水（作為CK）、化學(xué)農(nóng)藥10%吡蟲啉（作為B組）和40%毒死蜱（作為C組）進(jìn)行防效試驗(yàn)對比。每個試驗(yàn)處理小區(qū)面積15 m2，重復(fù)3次試驗(yàn)，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，采用背負(fù)式手動噴霧器噴霧，噴液量為600 kg/hm2。為了防止處理間相互干擾，施藥時用塑料膜遮隔相鄰小區(qū)。處理前在小區(qū)內(nèi)5點(diǎn)取樣，每個點(diǎn)選2株植株，并在選定植株上標(biāo)定3片無翅成蚜寄生量不少于50頭的葉片，調(diào)查蟲口基數(shù)，于處理后3、5、7、15 d統(tǒng)計蚜蟲死亡情況，計算防治效果，具體計算公式：

蟲口減退率=（處理前蟲口基數(shù)-處理后各天殘留蟲數(shù)）/處理前蟲口基數(shù)×100%

防治效果=（處理區(qū)蟲口減退率-對照區(qū)蟲口減退率）/（100-對照區(qū)蟲口減退率）×100%

1.5?殺蚜菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察菌株培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)，顯微鏡觀察菌絲及孢子形態(tài)特征。參照《真菌鑒定手冊》[15]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定：提取目的菌株基因組DNA，以通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列為 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGC;ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC;PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離、檢測，切膠純化后送至上海生工科技有限公司測序，所得 18S rDNA 基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast基因同源性比對。

2?結(jié)果與分析

2.1?分離結(jié)果

在PDA平板中出現(xiàn)4種不同真菌菌落，用接種針分別將上述4株菌挑取到PDA平板中進(jìn)行純化。將純化后的4株菌株分別再進(jìn)行平板產(chǎn)孢培養(yǎng)，72 h后，制成相同濃度的孢子懸浮液100 mL（添加0.2%的吐溫80），對蘿卜蚜蟲進(jìn)行噴霧，選出3號菌株對蚜蟲具有殺滅作用，得到具有殺蚜活性的純化菌株。

2.2?殺蚜真菌的固體發(fā)酵孢子含量

按照2%接種量接種到不同碳氮比、水分固體物料上，28 ℃培養(yǎng)72 h，相對濕度75%以上，產(chǎn)生孢子后，經(jīng)過3 d的自然風(fēng)干，粉碎后獲得殺蚜菌株的固體孢子粉，采用PDA平板活菌計數(shù)方法[16]，統(tǒng)計分析有效活菌數(shù)，結(jié)果見表2。由表2可知，固體發(fā)酵料組合Ⅳ對于發(fā)酵殺蚜真菌而言最適合，有效活菌含量達(dá)3.0×109 CFU/g，是較理想的殺蚜真菌固體發(fā)酵料。

2.3?蚜蟲防效分析

在大棚西葫蘆和露天棉花上進(jìn)行蚜蟲的防治效果試驗(yàn)，通過蚜蟲減退率和防效2個技術(shù)指標(biāo)，確定該菌株使用稀釋濃度（含量），與化學(xué)殺蚜農(nóng)藥進(jìn)行對比，比較該株菌劑對蚜蟲的持續(xù)控制時間[17-21]。不同稀釋比例的殺蚜菌株對西葫蘆蚜蟲的防治效果見表3，殺蚜菌株與化學(xué)農(nóng)藥蚜蟲防效比較見表4。

從表3可以看出，噴霧處理3 d后，稀釋倍數(shù)1∶500與稀釋倍數(shù) 1∶750的寄生曲霉菌孢子粉產(chǎn)品對蚜蟲的防治效果差異不顯著，而稀釋倍數(shù)1∶500和1∶750與稀釋倍數(shù)1∶1 000的寄生曲霉菌孢子粉產(chǎn)品存在顯著差異。同時，噴霧處理后3 d稀釋倍數(shù)1∶500與 1∶750蚜蟲防效均在90%以上，稀釋倍數(shù)1∶1 000的蚜蟲防效也在89%以上。表明寄生曲霉對蚜蟲的防治效果顯著，說明噴施5 d后蚜蟲基本均被感染，7 d后也是持續(xù)控制狀態(tài)。

1∶750殺蚜菌株對棉蚜有明顯的控制效果，1～3 d后，殺蚜菌株與10%吡蟲啉和40%毒死蜱差異不顯著，隨著處理時間的延長，處理5～15 d后，其防效維持在98%以上，與10%吡蟲啉和40%毒死蜱防治效果存在顯著差異。

2.4?殺蚜菌株的鑒定結(jié)果

所得菌落初為白色，黃綠色，繼而變成黃褐色，分生孢子頭呈放射形，少有疏松柱狀，分生孢子梗多為單層，少有雙層，分生孢子橢圓形（圖1、2）。將在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d后得到的菌株菌落，提取其基因組DNA，并采用常規(guī)的寄生曲霉菌DNA擴(kuò)展引物對該DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并分別用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，切割所需DNA目的條帶對該菌株ITS DNA序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast基因同源性比對，該菌株與曲霉屬（Aspergillus）的寄生曲霉（Aspergillu sparasiticus）基因同源性概率達(dá)98%以上，綜合該菌株的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)、培養(yǎng)條件及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，該菌株屬于曲霉屬（Aspergillus）的寄生曲霉（Aspergillu sparasiticus）。

3?討論

蚜蟲病原真菌主要分布在接合菌亞門和半知菌亞門。在接合菌亞門真菌中，蟲霉目（Entomophthorales）真菌是一類世界性廣布的蟲生真菌，在控制蚜蟲方面占有重要地位。據(jù)統(tǒng)計，到目前為止，在蟲霉目中以蚜蟲為寄主的種類有6屬21種[22]。卷枝毛霉（Mucorcircinelloides Van Tieghem）對蚜蟲（Entalonia nigronervosa Coq）具有較好的致死效果，在蚜蟲生物防治中應(yīng)用最廣的真菌殺蟲劑是蠟蚧輪枝菌（V.lecanii），屬于半知菌亞門，在熱帶、亞熱帶和溫帶都有分布[23]。蠟蚧輪枝菌寄主范圍廣，主要在蚧殼蟲和蚜蟲上。蟲生鐮刀菌 （Fusarium sp.） 在自然界普遍分布，在一定條件下對控制蚜蟲種群起著重要作用[24]。寄生曲霉 （Aspergillus parasiticus）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、青霉 （Pencillium sp.）、球孢白僵菌 （Beauveria bassiana）、粉質(zhì)擬青霉 （Paecilomyces farinosus）和布氏白僵菌（B.brongniartii）侵染蚜蟲的報道也不少，鮮見成熟應(yīng)用的案例。

該研究從自然感染死亡的蚜蟲體中，分離出具有殺蚜活性的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）菌株，采用固體發(fā)酵產(chǎn)生孢子，高含量的孢子粉作為侵染單元，通過在小西葫蘆上瓜蚜進(jìn)行生防試驗(yàn)以及在棉田中對棉蚜的防治效果進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵染力和持續(xù)控制力，持效期長達(dá)15 d以上。擴(kuò)充殺蚜真菌的資源庫、提高蚜蟲生防真菌殺蚜廣譜性，為開發(fā)新型殺蚜微生物農(nóng)藥提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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