伍利華，鐘林江，楊俊莉，張小雪，馬焓彬，劉 濤

(成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

0 引 言

金蓮花系列制劑由金蓮花一味中藥制得，包括金蓮花口服液、金蓮花片、金蓮花膠囊和金蓮花顆粒，是《中國藥典》2015版一部收錄中藥單味制劑，臨床用于上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎等。研究發(fā)現(xiàn)，各劑型生產工藝參數(shù)不同，劑型有異，而功能主治現(xiàn)象卻完全相同[1]，由于制備工藝不同，藥效物質基礎可能存在差異，其合理性有待評價。

中藥譜效關系是指建立在中藥指紋圖譜的研究基礎上，最大限度地獲取有用的化學信息，將標示物質與藥效結果聯(lián)合分析，為確定中藥質量藥效物質基礎、制定反應產品內在質量的控制標準而進行的研究[2]。中藥譜效關系通過化學成分研究結合藥理研究，能夠闡明有效化學成分的整體療效及其相互間關系，構建的藥效指紋圖譜能更有針對性的控制中藥質量。

金蓮花化學成分復雜，多數(shù)為黃酮類化何物，主要包括葒草苷、牡荊素及其衍生物等。目前對金蓮花制劑的研究大多是對一種制劑進行含量測定、指紋圖譜和藥理研究，未檢索到關于金蓮花4種制劑對比研究和聯(lián)合藥效的文獻[3-6]。中藥發(fā)揮藥效作用物質基礎復雜，可能不是單一成分起效，而目前指紋圖譜也僅體現(xiàn)某一波長項下可被檢測的物質，僅用指紋圖譜無法表征其臨床藥效。本文采用高效液相色譜法建立金蓮花4種制劑的指紋圖譜，并以藥用生藥量為指標，測定金蓮花4種制劑對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的最小抑菌生藥量。通過相關性分析，探討指紋圖譜特征峰與抑菌活性的相關性，并以此對劑型進行再評價。

1 儀器與試藥

DZTW電子調溫電熱套（天津市靜?？h工興電器廠）；FA2004 分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（成都康宇科技有限公司）；麥氏比濁管（溫州市康泰生物科技有限公司）；DZF-6050A真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；JJCJ-2FD潔凈工作臺（蘇州金凈凈化有限公司）；XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新木醫(yī)療器械有限公司）；DH-系列電熱培養(yǎng)箱（西安禾普科技有限公司）；P230Ⅱ高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）。

金蓮花（購自成都市荷花池中藥材市場，批號20180219），經成都大學藥學與生物工程學院劉濤研究員級高級工程師鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花Trollius chinensisBunge的干燥花。葒草苷對照品（批號 wkq16031602，HPLC≥98.0%）、牡荊素對照品（批號 wkq16031606，HPLC≥98.0%），對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司。磷酸（成都市科龍化工試劑廠，批號 20170951，含量≥85.0%）；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑為分析純，水為怡寶純凈水。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均由成都大學生物技術實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 金蓮花系列制劑的制備

目前市場上出售的金蓮花制劑有金蓮花口服液、金蓮花片劑、金蓮花顆粒及金蓮花膠囊等，各個廠家生產環(huán)境、原藥材來源、設備設施各異，制備工藝參數(shù)有別，工藝規(guī)程有異，上市產品質量差異較大，且可能存在藥用輔料對抑菌活性測定的影響，為減少實驗誤差，故本實驗未購買已上市金蓮花系列制劑作為樣品而是按照《中國藥典》2015年版一部相應品種項下的工藝參數(shù)制備。

按照《中國藥典》2015年版一部金蓮花制劑項下制備方法，分別制得生藥量為0.454 5 g/mL、3.017 2 g/g、2.882 8 g/g、2.916 9 g/g 的金蓮花口服液、金蓮花片、金蓮花顆粒及金蓮花膠囊。

2.2 金蓮花4種制劑的最小抑菌生藥量測定

2.2.1 金蓮花 4 種制劑供試品儲備液制備

以口服液為標準，根據(jù)相同生藥量，分別取金蓮花4種制劑適量，精密稱定金蓮花膠囊、片及顆粒 4.045 1 g、4.288 7 g、4.227 5 g 于 25 mL 容量瓶中，加純凈水定容搖勻制得 0.161 8 g/mL、0.171 5 g/mL、0.169 1 g/mL 的供試品儲備液。

2.2.2 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板的配制

稱取營養(yǎng)肉湯粉末約 3 g，加入 100 mL蒸餾水，攪拌溶解即得營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。稱取牛肉浸膏0.6 g、蛋白胨2 g、瓊脂 3～4 g、氯化鈉1 g，加水200 mL，加熱攪拌溶解即得。取滅菌培養(yǎng)皿，倒入15 mL培養(yǎng)基，冷卻，即得牛肉膏蛋白胨平板，備用。

2.2.3 菌液配制

取兩支滅菌試管加入適量無菌水，冷卻至室溫，接種環(huán)灼燒后分別挑取適量大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，與麥氏比濁管比對，制成 1.5×108CFU/mL的菌液，備用。

2.2.4 最小抑菌生藥量測定

取編號為1～11的試管，每支試管按供試品儲備液：培養(yǎng)基體積比1∶1加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，1～5號為大腸桿菌組（5號不加藥液，為陰性對照），6號為空白（不加菌液），7～11為金黃色葡萄球菌組（11號不加藥液，為陰性對照）；分別按試管二倍稀釋法制得 1～5號大腸桿菌試管組和7～11號金黃色葡萄球菌試管組；加入50 μL菌液、棉塞塞住試管口于37 ℃下培養(yǎng)24 h后，取2.2.2所得平板劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定結果見表1。結果表明金蓮花口服液抑菌生藥量最小，抑菌效果最優(yōu)。

表1 金蓮花系列制劑抑菌生藥量

2.3 金蓮花系列制劑指紋圖譜的建立

2.3.1 供試品溶液的制備

精密量取2.2.1項下供試品儲備液1.00 mL于50 mL容量瓶中，加純凈水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱定牡荊素對照品5.61 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得224.4 μg/mL的牡荊素貯備液。精密稱定葒草苷對照品10.00 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得200.0 μg/mL的葒草苷貯備液。精密量取牡荊素貯備液2.00 mL、葒草苷貯備液1.00 mL，混合至5 mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻得 97.92 μg/mL 牡荊素、40 μg/mL 葒草苷混合對照品溶液，作為混合對照品指認色譜峰。

2.3.3 色譜條件

Supersil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.2% 磷酸（B）；體積流量1.0 mL/min，進樣體積 10 μL；檢測波長 220 nm；柱溫 30 ℃，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫條件

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取金蓮花口服液按2.3.1項方法制備供試品溶液，將同一供試品溶液分別于 0，2，4，6，8，10，12 h進樣分析，計算其各共有峰相對峰面積和相對保留時間，其RSD值分別小于3.00%和2.00%，結果表明供試品在12 h內穩(wěn)定，詳見表3。

2.3.5 精密度試驗

取金蓮花口服液按2.3.1項下方法制備供試品溶液，同一供試品溶液重復進樣6次，計算其各共有峰相對峰面積和相對保留時間，其RSD值分別小于2.90%和1.20%，結果表明儀器精密度良好，詳見表4。

2.3.6 重復性試驗

取金蓮花口服液按2.3.1項方法平行制備供試品溶液6份，進樣分析，計算其各共有峰相對峰面積及相對保留時間，其RSD值分別小于2.00%和1.00%。結果表明供試品溶液重復性良好，詳見表5。

表4 精密度實驗結果

2.3.7 指紋圖譜的建立

取金蓮花4種制劑，按2.3.1項下方法制備供試品溶液，按2.3.3項下色譜方法進行測定，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（藥典委員會2004A版）”對數(shù)據(jù)進行分析，確定了13個共有峰。金蓮花4種制劑指紋圖譜如圖1～圖4所示。經對照品HPLC圖譜指認，確認10號和12號峰分別為葒草苷和牡荊素?；旌蠈φ掌穲D譜見圖5。

表5 重復性實驗結果

圖1 金蓮花口服液HPLC指紋圖譜

圖2 金蓮花片HPLC指紋圖譜

3 金蓮花4種制劑HPLC指紋圖譜相似度分析

圖3 金蓮花膠囊HPLC指紋圖譜

圖4 金蓮花顆粒HPLC指紋圖譜

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（藥典委員會2004A版）”對金蓮花4種制劑指紋圖譜進行相似度分析，以金蓮花口服液為對照指紋圖譜，色譜峰自動匹配；結果表明金蓮花顆粒、金蓮花膠囊、金蓮花片的相似度分別為0.996、0.980、0.978。譜圖見圖6。S2為金蓮花口服液對照譜圖，S1、S3、S4分別為金蓮花顆粒、金蓮花片及金蓮花膠囊。

4 金蓮花系列制劑譜-效相關性分析

文獻研究表明[7]，金蓮花中抑菌活性成分為葒草苷，在金蓮花系列制劑指紋圖譜中，10號峰經對照品指認為葒草苷，且分離度良好，故選擇金蓮花系列制劑指紋圖譜中10號峰為參照峰，其相對峰面積比值為1，計算金蓮花系4種制劑指紋圖譜中共有色譜峰的相對峰面積。采用“Statistical Product and Service Solutions”軟件進行相關性分析[8-9]，得到各個共有峰與抑菌作用的相關性。表6為金蓮花制劑指紋圖譜共有峰面積相對峰面積與抑菌生藥量的相關性分析結果，由2.2.4可知，所需的抑菌生藥量越低，其抑菌活性越強。由表可知峰1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 與抑菌生藥量成負相關，即與抑菌活性成正相關，峰2、13與抑菌活性成負相關。其中，峰1、7、8、9、11對金黃色葡萄球菌抑菌作用相關性與其他峰相比較有顯著性差異（P＜0.05），峰 3（P＜0.05）、峰 12（P＜0.01）對大腸桿菌的抑菌作用相關性也有顯著差異。12號峰經對照品指認為牡荊素，具有一定抗炎作用[10]。

圖5 混合對照圖譜

圖6 金蓮花四種制劑HPLC指紋圖譜相似度分析

5 結束語

藥物是臨床用于預防治療疾病的物質，理想的質量標準能夠控制藥物的安全性和有效性，但目前中藥質量的控制方法、評價指標以及標準與中藥的有效性關聯(lián)不強，缺少能夠反映中藥有效性的質量控制體系。中藥譜效關系的建立可以確定中藥藥效物質基礎、為制定反映產品內在質量的控制標準提供依據(jù)。

目前譜效分析研究多應用于中藥材及中藥注射液化學指紋圖譜與體外活性的相關性，未發(fā)現(xiàn)采用譜-效關系對中藥系列制劑進行再評價的研究[11-13]，本文通過對金蓮花系列制劑的譜-效研究，發(fā)現(xiàn)了在本色譜條件下，峰1、7、8、9、11對金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌作用，峰3與峰12對大腸桿菌的抑菌也有顯著作用，表明在生產工藝及質量控制過程中，應著重地對這7個峰進行重點關注。由于中藥的功能主治多樣，構建的譜效模型能否闡明藥物所有活性的物質基礎有待進一步研究。

表6 金蓮花系列制劑指紋圖譜共有峰相對峰面積及與抑菌生藥量相關性1)-3)

本文通過對金蓮花系列制劑化學指紋圖譜建立與體外抑菌活性測定，綜合譜效相關性，結果表明金蓮花口服液劑型優(yōu)于金蓮花顆粒、金蓮花片和金蓮花膠囊，即不同的生產制備工藝對各制劑化學成分有一定影響，從而出現(xiàn)體外抑菌活性出現(xiàn)差異。藥物的活性成分需進入血液后才能發(fā)揮作用，本研究采用體外生物活性測定，藥效指標不能完全反映對人體藥理效應，后續(xù)研究將建立動物模型測定金蓮花制劑體內生物活性，我們目前僅指認兩個色譜峰，后續(xù)將采用液質聯(lián)用等技術對其他色譜峰進行分析指認；金蓮花抗菌譜較廣，后續(xù)研究將對金葡菌和大腸桿菌之外的細菌（如肺炎鏈球菌等）展開研究，較為全面地對4種劑型的適應癥進行再評價研究。