劉鑫陽 田瑞華

摘要 [目的]研究黃貯對玉米秸稈的品質(zhì)及微生物多樣性的影響。[方法]采用現(xiàn)行有效的測定方法及高通量測序，對黃貯玉米秸稈飼料的營養(yǎng)品質(zhì)及微生物進行了研究。[結果]經(jīng)過98 d的黃貯，玉米秸稈的總酸含量提高了31.62%，粗纖維含量降低了39.92%，粗蛋白含量提高了8.53%，細菌群落豐富度和多樣性明顯降低，細菌群落組成由初始的藍藻科某些屬為主導變?yōu)橐匀樗峋鸀橹鲗?。[結論]黃貯有效改善了秸稈飼料的營養(yǎng)品質(zhì)及微生物群落組成。

關鍵詞 黃貯;高通量測序;微生物多樣性;營養(yǎng)品質(zhì)

中圖分類號 S816.6文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0197-04

Abstract [Objective] To study the effects of yellowstorage on the quality and microbial diversity of corn straw. [Method] The nutritional quality and microbial diversity of yellowstorage corn straw feed were analyzed by using current effective methods and high throughput sequencing.[Result] The results showed that the total acid content of maize straw increased by 31.62%， cellulose content decreased by 39.92%， crude protein content increased by 8.53% after 98 days of yellowstorage. The richness and diversity of bacterial community decreased obviously， and the composition of bacterial community changed from initial miscellaneous bacteria to lactobacillusdominated structure distribution. [Conclusion] The nutritional quality and microbial community composition of straw feed were effectively improved by yellowstorage.

Key words Yellowstorage;High throughput sequencing;Microbial diversity;Nutritional quality

隨著人們生活水平的不斷提高，對肉制品的需求也不斷增加，使得畜牧業(yè)的發(fā)展越來越快，但同樣也面臨著自然環(huán)境變化、天然草場產(chǎn)量下降等問題，開發(fā)新的能源已成為學者們熱切關注的問題。我國秸稈資源非常豐富，年產(chǎn)量高達7億多t[1]，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的20%～30%，但用于制作飼料的量不到20%。若將這么多的秸稈焚燒會造成嚴重的環(huán)境污染，堆積會造成不必要的浪費，秸稈還田也會增加農(nóng)作物的倒伏以及病蟲害的危害。這些秸稈如果能被合理利用，制成飼料，不僅解決了資源浪費和秸稈焚燒帶來的環(huán)境污染問題，而且解決了畜牧發(fā)展中存在的一些問題。玉米秸稈主要是由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，其質(zhì)地粗硬，營養(yǎng)價值低，影響家畜的消化率和采食量。微生物發(fā)酵可以顯著降低玉米秸稈中半纖維素和纖維素的含量[2]，提高飼料作物的消化率[3]。通過微生物發(fā)酵既改善了玉米秸稈的適口性，也提高了玉米秸稈的營養(yǎng)品質(zhì)。

高通量測序技術是近年來新興發(fā)展起來的免培養(yǎng)分子生物學技術，又稱新一代測序技術[4]。因為高通量測序具有讀數(shù)長、效率高、靈敏度高等特點，可最大限度地保留菌群原有的群落組成和分布特征，是一個研究微生物多樣性的重要手段[5-7]。目前，高通量測序技術在人類基因組、青貯微生物、腸道微生物、土壤微生物、植物根根際及內(nèi)生菌等多種環(huán)境微生物生態(tài)的研究中都有應用[8-13]。高通量測序技術雖然已被廣泛應用，但該技術在黃貯中應用得較少，且目前對黃貯飼料中菌群結構的研究基本處于空白。筆者利用高通量測序技術分析了黃貯對玉米秸稈中微生物多樣性的影響，結合現(xiàn)行有效的方法分析了黃貯對玉米秸稈中總酸含量、粗纖維含量及粗蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

超低溫冰箱 DW-86L388A（青島海爾特種電器有限公司）、移液器 Eppendorf N13462C（Eppendorf）、小型離心機 Eppendorf 5430 R（Eppendorf）、高速臺式冷凍離心機 Eppendorf 5424R（Eppendorf）、超微量分光光度計 NanoDrop2000（Thermo FisherScientific）、電泳儀 DYY-6C（北京市六一儀器廠）、MISEQ 測序儀 Illumina Miseq（Illumina）、酶標儀 BioTek ELx800（Biotek）。

1.2 主要試劑

DNA 抽提試劑盒、2% agarose gels、FastPfu Polymerase、AxyPrep DNA GelExtraction Kit、MiSeqplatform、FastDNASPINKitforSoil、酚酞、氫氧化鈉、纖維濾袋、濃硫酸、無水葡萄糖、纖維濾袋、混合催化劑、混合指示劑、硼酸、鹽酸、DNS試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣方法。

玉米秸稈黃貯池共3個，均為長、寬、高各2 m的池子，玉米秸稈黃貯時間為98 d，分別在玉米秸稈黃貯封窖前及98 d黃貯結束過后進行取樣。在黃貯池的1 m深處分別取5個樣，將取出的玉米秸稈樣品進行充分混合，然后平均分成3份放入自封袋中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 黃貯秸稈樣品的品質(zhì)指標測定。

玉米秸稈黃貯過程中品質(zhì)指標的測定參照現(xiàn)行有效的分析方法[14-16]。

1.3.3 Illumina Miseq 高通量測序。

1.3.3.1 DNA抽提與PCR擴增。

參照FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒說明書對玉米秸稈樣品進行總DNA提取，并利用NanoDrop2000對DNA的純度和濃度進行檢測，利用806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）和338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）引物對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。

1.3.3.2 Illumina Miseq測序。

利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），將原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI網(wǎng)站進行比對。

1.3.3.3 數(shù)據(jù)處理。

原始測序的序列使用Trimmomatic 軟件進行質(zhì)控，并使用FLASH軟件進行拼接。

2 結果與分析

2.1 黃貯玉米秸稈的品質(zhì)指標測定

為了解黃貯玉米秸稈的表型特征，對黃貯玉米秸稈的總酸含量、粗纖維含量、粗蛋白含量這3個重要品質(zhì)指標進行測定，測定結果見表1。

由表1可以看出，通過黃貯發(fā)酵的玉米秸稈總酸含量由初始的8.57 g/kg升高到11.28 g/kg。與未進行黃貯發(fā)酵的玉米秸稈相比，經(jīng)過黃貯發(fā)酵的玉米秸稈總酸含量提高了31.62%，這說明黃貯顯著提高了秸稈中的總酸含量;粗纖維含量由初始的34.47%降低到20.71%，與未進行黃貯發(fā)酵的玉米秸稈相比，經(jīng)過黃貯發(fā)酵后的玉米秸稈粗纖維含量降低了39.92%，說明黃貯顯著降低了玉米秸稈中粗纖維的含量;粗蛋白含量由初始的3.87%提高到4.20%，與未進行黃貯發(fā)酵的玉米秸稈相比，經(jīng)過黃貯發(fā)酵的玉米秸稈粗蛋白含量提高了8.53%，說明黃貯有效提高了玉米秸稈中粗纖維的含量。

2.2 玉米秸稈黃貯的 Illumina Miseq 高通量測序

2.2.1 黃貯玉米秸稈樣品中細菌16S rRNA的Illumina測序的稀釋曲線。

稀釋曲線（rarefaction curve）主要利用各樣本在不同測序深度時的微生物α多樣性指數(shù)構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)據(jù)量時的微生物多樣性，也可以用來說明樣本測序數(shù)據(jù)量的合理性。稀釋曲線采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們對應的物種（OTU）數(shù)目或多樣性指數(shù)，構建稀釋曲線。該研究采用Shannon-Wiener指數(shù)，選擇97%相似度的OTU水平，利用mothur計算不同隨機抽樣下的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，利用R語言工具繪制稀釋曲線。當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多的新物種。

圖1為黃貯玉米秸稈樣品的細菌稀釋曲線，隨著樣本序列數(shù)的增加，檢測到OTU數(shù)量的增加量逐漸減小，曲線趨于平坦，這說明該試驗測序的數(shù)據(jù)量比較合理，通過檢測獲得了樣品細菌群落中絕大多數(shù)OTU水平上的物種。

2.2.2 黃貯玉米秸稈樣品中細菌的α-多樣性。

通過chao指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、物種覆蓋度指數(shù)對黃貯玉米秸稈樣品中細菌的α多樣性進行分析。chao指數(shù)是描述物種豐富度chao1指數(shù)，是用chao1算法估計樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，用來估計物種總數(shù);Shannon-Wiener指數(shù)是反映多樣性的指數(shù)，其值越高說明群落多樣性越高;物種覆蓋度指數(shù)（coverage）是反映群落覆蓋度的指數(shù)，其數(shù)值越高則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低，該指數(shù)反映此次測序結果是否代表樣本中微生物的真實情況。

從表2可以看出，黃貯玉米秸稈樣品中細菌的物種覆蓋度均在0.99以上，說明樣本中序列被測出的概率很高，且此次試驗數(shù)據(jù)代表了樣本中微生物的真實情況。經(jīng)過98 d黃貯后，3個黃貯池中玉米秸稈細菌的Shannon-Wiener指數(shù)和chao指數(shù)均顯著降低，說明黃貯降低了玉米秸稈中細菌的豐富度和多樣性。

2.2.3 黃貯玉米秸稈樣品中細菌群落分類學分析。

2.2.3.1 黃貯玉米秸稈中細菌群落在門水平上的結構分布。

通過與Silva數(shù)據(jù)庫進行對比發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈初始的細菌群落由19個門組成，經(jīng)過98 d黃貯后玉米秸稈中細菌群落變?yōu)?8個門。

從圖2可以看出，玉米秸稈初始的細菌群落中藍藻門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）占據(jù)明顯的優(yōu)勢地位，此外還有擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）等一些相對豐度較低的細菌門類。黃貯98 d后的細菌群落中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門占據(jù)明顯的優(yōu)勢地位，此外還有擬桿菌門和放線菌門等相對豐度較低的門類。這說明黃貯明顯改變了細菌在門水平上的結構分布。

2.2.3.2 黃貯玉米秸稈中細菌群落在屬水平上的結構分布。

通過與Silva數(shù)據(jù)庫進行對比發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈初始的細菌群落由349個屬組成，經(jīng)過98 d黃貯后玉米秸稈中細菌群落變?yōu)?23個屬。

從圖3可以看出，玉米秸稈初始的細菌群落中藍藻科的某些屬占據(jù)明顯的優(yōu)勢地位，此外還有泛菌屬、鞘脂單胞菌屬、根瘤菌屬等一些相對豐度較低的屬。黃貯98 d后的細菌群落中，乳桿菌屬代替了藍藻科某些屬的優(yōu)勢地位，成為優(yōu)勢菌屬，此外還有片球菌、乳球菌等一些相對豐度較低的菌屬。由黃貯玉米秸稈中細菌群落在屬水平上的結構分布可以看出，經(jīng)過98 d的黃貯，秸稈飼料中細菌群落的組成由一些雜菌變?yōu)槿樗峋鲗?。乳酸菌分為同型發(fā)酵乳酸菌、異型發(fā)酵乳酸菌和兼性異型發(fā)酵乳酸菌。其中，同型發(fā)酵乳酸菌可以快速降低pH、增加乳酸菌數(shù)量和乳酸含量;專性異型發(fā)酵乳酸菌具有增加有氧穩(wěn)定性的作用;兼性異型發(fā)酵乳酸菌具有二者聯(lián)合的作用[17]。

3 結論

總酸含量是衡量玉米秸稈黃貯發(fā)酵秸稈品質(zhì)的一個重要指標，相對較高的總酸含量不僅可以抑制黃貯發(fā)酵秸稈中雜菌的生長，而且可以增加黃貯發(fā)酵秸稈的有氧穩(wěn)定性。玉米秸稈飼料中纖維素的存在會影響飼料的適口性，含有很多不能被動物消化和利用的物質(zhì)，因此降低玉米秸稈中的纖維含量是必要的;黃貯飼料中蛋白的存在可以有效改善飼料的營養(yǎng)價值，從而提高飼料的飼用價值，因此飼料中蛋白含量是衡量黃貯飼料品質(zhì)的一個重要指標。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)秸稈經(jīng)青貯后總酸的含量顯著提高，有效抑制了秸稈中有害菌的生長，提高飼料的品質(zhì)。Hu等[19]、Nsereko等[20]、Zayed等[21]研究發(fā)現(xiàn)青貯可以顯著提高秸稈飼料的干物質(zhì)、粗蛋白等含量以及纖維素的降解率。該研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈經(jīng)黃貯后有效提高了玉米秸稈的總酸及粗蛋白的含量，顯著降低了秸稈的粗纖維含量，提高了玉米秸稈的營養(yǎng)品質(zhì)，這與上述研究結果相似。

經(jīng)過黃貯發(fā)酵，玉米秸稈中的細菌豐富度和多樣性都有所降低。Li等[22]對丁香和黑麥草進行青貯，結果表明青貯降低了丁香和黑麥草飼料的細菌豐富度，與該研究結果相似。Ogunade等[9]研究發(fā)現(xiàn)苜蓿青貯飼料細菌群落中74.1%和20.4%的細菌分別屬于厚壁菌門和變形菌門。Ogunade等[23]對玉米秸稈進行青貯，通過對青貯飼料的細菌多樣性分析表明青貯可以改變飼料中的細菌群落組成。結果表明，玉米青貯飼料中涉及乳酸發(fā)酵的細菌群落中，98.3%屬于厚壁菌門，96.5%屬于乳酸桿菌屬，與該研究結果相似。

通過對黃貯玉米秸稈飼料的品質(zhì)指標進行分析，發(fā)現(xiàn)黃貯有效改善了秸稈飼料中總酸、粗纖維和粗蛋白的含量。通過對黃貯玉米秸稈飼料的微生物進行分析，發(fā)現(xiàn)黃貯顯著降低了秸稈飼料中細菌群落的豐富度和多樣性，并明顯改變了玉米秸稈飼料中細菌群落的結構組成。

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