李玉玲，劉曉力，許娜，唐加明，陸紫媛△

細(xì)胞周期性激酶抑制因子A（CDKN2A）位于9p21.3 區(qū)域，是重要的抑癌基因，其編碼p16（INK4a）和p14（ARF）兩種周期抑制蛋白。其中p16通過抑制CDK4/6-cyclinD 復(fù)合物激酶活性，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）蛋白呈持續(xù)高磷酸化的活化狀態(tài)，從而抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入到S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯［1］。目前已在食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、膀胱癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)p16基因缺失，p16基因缺失同時(shí)也是急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）中最常見的拷貝數(shù)改變（CNAS）［2］。有研究證實(shí)p16基因缺失是B-ALL的獨(dú)立不良預(yù)后因素［3］，p16基因缺失影響費(fèi)城染色體（Ph）陽(yáng)性B-ALL對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的治療敏感性，使Ph陽(yáng)性B-ALL患者的預(yù)后變差［4］。Ph陰性B-ALL 與Ph 陽(yáng)性B-ALL 具有很大的異質(zhì)性，但目前尚少見p16 基因缺失對(duì)成人Ph 陰性B-ALL患者預(yù)后影響的相關(guān)報(bào)道。本研究通過大樣本量分析p16 基因缺失的成人Ph 陰性B-ALL 患者的臨床特征、免疫分型特點(diǎn)及預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年1月—2018年6月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液內(nèi)科確診為Ph陰性的B-ALL患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初診時(shí)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查確診為急性B-ALL患者。（2）細(xì)胞遺傳學(xué)檢查為Ph陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未接受規(guī)律治療者。（2）中途失訪者。（3）由于個(gè)人原因未行所有檢查者。按上述標(biāo)準(zhǔn)最終納入210例患者（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院78例，南方醫(yī)院132例）為研究對(duì)象，其中男125 例，女85 例，年齡 18～63 歲，中位年齡為 32.5 歲。根據(jù)初發(fā)時(shí)檢測(cè)的p16基因狀態(tài)分為p16基因缺失組（61例）和無(wú)缺失組（149例）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 查閱患者初次診斷時(shí)血常規(guī)、肝脾B超結(jié)果，收集血常規(guī)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）及B超中肝脾腫大情況、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果中的骨髓原始細(xì)胞比例、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)等臨床資料。

1.2.2 免疫分型檢測(cè) 采用直接免疫熒光法，3 種熒光抗體熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）/紅蛋白（PE）/多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）、紅細(xì)胞裂解液、鞘液（PBS）均購(gòu)自美國(guó)Bection Dickinson 公司，使用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（480 nm 氬離子為激發(fā)光源，美國(guó)Bection Dickinson公司）進(jìn)行檢測(cè)。所檢測(cè)抗原包括：白細(xì)胞抗原34（CD34）、人白細(xì)胞分化抗原DR（HLA-DR）、CD45、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶抗原（TdT）、CD117、CD10、CD19、CD20、CD22、CD13、CD14、CD15、CD33、CD2、CD3、CD7、CD56、CD64、CD11b、胞漿髓過氧化物酶抗原（cMPO）及白細(xì)胞胞漿抗原79a（cCD79a）。取肝素抗凝的白血病患者骨髓血2 mL，對(duì)每一份標(biāo)本設(shè)對(duì)照管和試驗(yàn)管。分別加入肝素抗凝全血100 μL，3種熒光標(biāo)記抗體各20 μL，室溫避光孵育約15 min，再加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，震蕩后置室溫10 min，離心后棄上清，用PBS 洗滌2 次，加入15 mL PBS，上機(jī)待檢。所有結(jié)果分析均參照白血病分型歐洲組標(biāo)準(zhǔn)（EGIL）［5］。

1.2.3 多探針熒光原位雜交（FISH） 采集患者新鮮的骨髓細(xì)胞，用間期熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)p16基因缺失、E2A與前B細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子1（E2A-PBXl）融合基因、混合系白血?。∕LL）斷裂基因、E26 白血病轉(zhuǎn)錄因子與急性髓系白血病基因1（TEL-AMLl）融合基因、前癌基因c-ABL與斷裂點(diǎn)簇集區(qū)BCR（BCR-ABL）融合基因、多倍體檢測(cè)、MYC斷裂基因及IGH 斷裂基因，8 個(gè)探針按設(shè)計(jì)組合標(biāo)記固定于一張檢測(cè)玻片，按試劑盒（英國(guó)Cytocell）操作說明進(jìn)行操作。所有結(jié)果的分析均采用人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN）2009 標(biāo)準(zhǔn)［6］，每份間期核標(biāo)本計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞。針對(duì)p16 缺失的探針組包括：覆蓋9p21 區(qū)域101 kb 的紅色探針，9 號(hào)染色體質(zhì)控探針（綠色）。正常細(xì)胞的熒光原位雜交信號(hào)為2紅2綠，1紅2 綠表明p16 基因從1 條染色體中缺失，即雜合性缺失，0紅2綠為純合性缺失，雜合性缺失與純合性缺失均定義為缺失，見圖1。

Fig.1 The p16 gene deletion detected by fluorescence in situ hybridization圖1 間期熒光原位分析p16基因缺失

1.2.4 危險(xiǎn)分組、治療方案及療效評(píng)估 根據(jù)2014NCCN 指南［7］，具有以下任一危險(xiǎn)因素均定義為高?；颊撸海?）Ph陽(yáng)性或BCR-ABL 基因陽(yáng)性；（2）MLL 基因重排；（3）初診時(shí)WBC≥30×109/L；（4）低二倍體數(shù)（染色體數(shù)＜44 條）。其余則為標(biāo)危組。210 例患者初次確診后住院接受規(guī)律治療，首先予標(biāo)準(zhǔn)的VILP（長(zhǎng)春新堿、去甲氧柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松）或VDLP（長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松）方案進(jìn)行誘導(dǎo)緩解，緩解后予Hyper CVAD A（環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、地塞米松）和Hyper CVAD B（大劑量甲氨蝶呤和阿糖胞苷）方案交替進(jìn)行鞏固治療，所有患者均行腰椎穿刺并前鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。97 例患者在鞏固2～5個(gè)療程后接受異基因造血干細(xì)胞移植，治療方案詳見參考文獻(xiàn)［4］，其余患者因經(jīng)濟(jì)、無(wú)合適供者或并發(fā)癥等原因只行單純化療。

療效評(píng)估：完全緩解（CR）定義為化療后患者骨髓中原始細(xì)胞≤0.050，外周血中性粒細(xì)胞≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)（PLT）≥100×109/L，白細(xì)胞分類中無(wú)白血病細(xì)胞，且無(wú)髓外白血病。復(fù)發(fā)定義為獲得完全緩解患者骨髓中原始細(xì)胞≥0.050或者發(fā)生髓外侵犯。

1.2.5 隨訪 對(duì)患者從確診后每3 個(gè)月進(jìn)行1 次電話隨訪，隨訪截止日期為2018年12月31 日?？偵鏁r(shí)間（OS）定義為初次確診日期至死亡日期或末次隨訪日。無(wú)病生存時(shí)間（DFS）定義為CR 至白血病復(fù)發(fā)或在CR 期間死亡或末次隨訪日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)、校正χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，并采用Log-rank 檢驗(yàn)比較生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p16基因缺失與無(wú)缺失患者的臨床基本特征比較 p16基因缺失組與無(wú)缺失組間性別、年齡、初診時(shí)WBC、骨髓中原始細(xì)胞比例、肝脾腫大及高?；颊弑壤町惥鶡o(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 p16基因缺失與無(wú)缺失患者免疫表型及細(xì)胞遺傳學(xué)比較 210例患者中有75例（35.7%）CD20抗原表達(dá)陽(yáng)性（CD20抗原表達(dá)＞20%），其中p16基因缺失組中伴CD20 表達(dá)者所占比例明顯高于無(wú)缺失組（P＜0.05），2 組患者間其余免疫表型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。p16基因缺失組與無(wú)缺失組間細(xì)胞遺傳學(xué)分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.3 p16 基因缺失與無(wú)缺失患者的療效及預(yù)后比較 （1）療效。p16 基因缺失組造血干細(xì)胞移植率和完全緩解率與無(wú)缺失組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)發(fā)率明顯高于無(wú)缺失組（χ2=12.027，P＜0.05），見表4。79 例復(fù)發(fā)患者中，4 例患者初發(fā)時(shí)未檢測(cè)出p16基因缺失，而復(fù)發(fā)時(shí)檢測(cè)出p16基因缺失，復(fù)發(fā)患者p16 基因缺失率明顯高于初發(fā)患者（χ2=9.254，P=0.002）。（2）預(yù)后。對(duì)210例患者進(jìn)行隨訪，中位隨訪時(shí)間為30（1～87）個(gè)月，p16 基因缺失組（61 例）中位OS和中位DFS分別為23個(gè)月和15個(gè)月，p16基因無(wú)缺失組（149 例）中位OS 和中位DFS 分別為40 個(gè)月和38個(gè)月，p16基因無(wú)缺失組患者OS和DFS明顯優(yōu)于 p16 基因缺失組（Log-rankχ2分別為 16.715、21.237，P＜0.05），見圖2、3。p16基因缺失組中接受造血干細(xì)胞移植患者中位OS 及中位DFS 分別為38個(gè)月和27 個(gè)月，接受化療患者中位OS 及中位DFS分別為17個(gè)月和10個(gè)月，接受造血干細(xì)胞移植患者的OS和DFS明顯優(yōu)于接受化療者（Log-rankχ2分別為25.316、20.637，P＜0.05），見圖4、5。

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups of patients表1 伴p16基因缺失組與無(wú)缺失組患者臨床特征的比較

Tab.2 Comparison of the immunophenotypes between two groups of patients表2 伴p16基因缺失與無(wú)缺失急性ph陰性B-ALL患者免疫表型的比較 ［例（%）］

Tab.3 Comparison of cytogenetics between two groups of patients表3 伴p16基因缺失與無(wú)缺失急性ph陰性B-ALL患者細(xì)胞遺傳學(xué)的比較 ［例（%）］

Tab.4 Comparison of the therapeutic efficacy between two groups of patients表4 伴p16基因缺失與不伴p16基因缺失急性ph陰性B-ALL患者治療療效的比較 ［例（%）］

Fig.2 Kaplan-Meier survival curves for overall survival in two groups of patients圖2 p16基因缺失組與無(wú)缺失組患者OS比較

Fig.3 Kaplan-Meier survival curves for disease free survival in two groups of patients圖3 p16基因缺失組與無(wú)缺失組患者DFS比較

2.4 伴CD20 陽(yáng)性表達(dá)的p16 基因缺失與無(wú)缺失患者預(yù)后比較 p16基因缺失組CD20陽(yáng)性、CD20陰性以及無(wú)缺失組CD20陽(yáng)性、CD20陰性患者的中位OS分別為 19 個(gè)月、29 個(gè)月、35 個(gè)月及 48 個(gè)月，中位DFS 分別為 11 個(gè)月、21 個(gè)月、32 個(gè)月及 38 個(gè)月。p16 基因缺失組 CD20 陽(yáng)性患者 OS 和 DFS 均明顯低于缺失組CD20陰性者（OS：Log-rankχ2=7.782；DFS：Log-rankχ2=5.733；均P＜0.05）、無(wú)缺失組 CD20 陽(yáng)性者（OS：Log-rankχ2=13.731；DFS：Log-rankχ2=17.450；均P＜0.05）及無(wú)缺失組CD20 陰性者（OS：Log-rankχ2=32.163；DFS：Log-rankχ2=34.372；均P＜0.05），無(wú)缺失組中CD20陽(yáng)性者與陰性者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OS：Log-rankχ2=0.289 6；DFS：Logrankχ2=0.074 2；均P＞0.05），見圖6、7。

Fig.4 Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients received Allo-HSCT treatment and chemotherapy treatment圖4 p16基因缺失移植組與化療組患者OS比較

Fig.5 Kaplan-Meier survival curves for disease free survival in patients received Allo-HSCT treatment and chemotherapy treatment圖5 p16基因缺失移植組與化療組患者DFS比較

Fig.6 Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients with different status of p16 gene and CD20圖6 p16基因缺失組CD20陽(yáng)性、CD20陰性以及無(wú)缺失組CD20陽(yáng)性、CD20陰性患者OS比較

2.5 伴p16 基因缺失的MLL 重排B-ALL 患者預(yù)后分析 5 例伴p16 基因缺失的MLL 重排患者中有3例復(fù)發(fā)；4 例患者在2年之內(nèi)死亡，僅1 例接受造血干細(xì)胞移植患者截至隨訪日止仍存活，其發(fā)病后生存時(shí)間為28個(gè)月。

Fig.7 Kaplan-Meier survival curves for disease free survival in patients with different status of p16 gene and CD20圖7 p16基因缺失組CD20陽(yáng)性、CD20陰性以及無(wú)缺失組CD20陽(yáng)性、CD20陰性患者DFS比較

3 討論

p16 基因缺失是成人ALL 最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)改變之一，目前多數(shù)研究認(rèn)為p16 基因缺失是ALL患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。本研究結(jié)果顯示，與無(wú)缺失組比較，p16 基因缺失組患者復(fù)發(fā)率高、2年OS和DFS率較低，與Braun等［8］的報(bào)道一致。本研究發(fā)現(xiàn)p16基因缺失率在復(fù)發(fā)患者中高于初發(fā)患者，有4 例患者初發(fā)時(shí)p16 基因無(wú)缺失，而復(fù)發(fā)時(shí)出現(xiàn)p16基因缺失，與Mullighan等［9］的報(bào)道一致，其研究發(fā)現(xiàn)部分ALL 復(fù)發(fā)患者出現(xiàn)基因拷貝缺失，其中56%為p16 基因缺失。對(duì)p16 基因缺失患者治療效果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞移植能明顯改善預(yù)后，與以往研究結(jié)果一致［3］。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)p16基因缺失與成人Ph 陰性B-ALL 患者的復(fù)發(fā)及進(jìn)展有關(guān)，造血干細(xì)胞移植能改善患者的預(yù)后。

本研究對(duì)患者的免疫分型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，p16基因缺失患者CD20 陽(yáng)性率明顯高于無(wú)缺失患者，p16基因缺失伴CD20陽(yáng)性患者的預(yù)后明顯差于p16基因缺失伴CD20 陰性患者；而在無(wú)p16 缺失患者中，CD20陽(yáng)性與CD20陰性組患者預(yù)后無(wú)明顯差異。目前關(guān)于CD20陽(yáng)性表達(dá)對(duì)于B-ALL預(yù)后的影響仍具有爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為CD20 表達(dá)陽(yáng)性對(duì)成人BALL預(yù)后無(wú)影響［10］，而多數(shù)研究認(rèn)為CD20是ALL患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，CD20陽(yáng)性ALL患者的3年持續(xù)緩解率及3年OS 率均明顯低于CD20陰性者［11］，CD20陽(yáng)性Ph陰性ALL患者3年累積復(fù)發(fā)率較CD20陰性者明顯升高［12］。有研究表明，利妥昔單抗聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療較單純化療能明顯提高CD20 陽(yáng)性ALL患者的預(yù)后［13-14］。

MLL重排是ALL患者預(yù)后不良的重要的遺傳學(xué)異常之一。目前關(guān)于p16基因缺失對(duì)MLL重排ALL患者預(yù)后影響的研究尚少見。Ohnishi 等［15］研究表明，示MLL 重排患者中p16 基因缺失率為19%，且p16基因缺失提示MLL重排患者預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，18 例 MLL 重排 ph 陰性 B-ALL 患者中，5例伴p16 基因缺失（27.7%），且其中4 例均于發(fā)病2年內(nèi)死亡，與Ohnishi等［15］的研究一致。有研究表明p16基因在MLL重排白血病細(xì)胞增殖及凋亡中起關(guān)鍵性作用，不同的上游基因，均通過抑制p16基因的表達(dá)，從而促進(jìn)MLL重排白血病細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡［16-17］。

綜上所述，p16 基因缺失是成人Ph 陰性ALL 患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，其在白血病的復(fù)發(fā)及進(jìn)展中起重要作用，造血干細(xì)胞移植能明顯改善該部分患者的預(yù)后。伴p16基因缺失患者CD20陽(yáng)性率高，這部分患者預(yù)后較差。在診斷時(shí)明確p16基因缺失狀態(tài)對(duì)于指導(dǎo)疾病危險(xiǎn)分層及選擇合適的治療方案具有重要意義。