李文周　陳艷艷　徐敏　鄧祖輝　李一圣

[摘要]目的 探討紅景天苷對(duì)過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（SHED）氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法 以H2O2刺激SHED建立氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、H2O2模型組和紅景天苷各劑量組（包括高、中、低劑量組）。以熒光染色劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察細(xì)胞形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定細(xì)胞丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性，免疫印跡法檢測(cè)p38和p-p38蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 顯微鏡下觀察，H2O2模型組的細(xì)胞變形明顯，部分細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中;紅景天苷低劑量組的細(xì)胞變形程度輕于H2O2模型組，脫落懸浮細(xì)胞較少;紅景天苷高劑量組的細(xì)胞形態(tài)更趨于正常形態(tài)，脫落少見。H2O2模型組、紅景天苷各劑量組的MDA含量均顯著高于空白對(duì)照組，且紅景天苷各劑量組的MDA含量均顯著低于H2O2模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。H2O2模型組、紅景天苷各劑量組的SOD活性均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;紅景天苷低劑量組的SOD活性與H2O2模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;紅景天苷高、中劑量組的SOD活性均高于H2O2模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。H2O2模型組、紅景天苷低劑量組的p38蛋白磷酸化水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;紅景天苷高劑量組的p38蛋白磷酸化水平低于H2O2模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 紅景天苷可保護(hù)SHED，減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制與抑制p38蛋白磷酸化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]紅景天苷;過氧化氫;人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞;氧化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R979.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）10（a）-0020-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of salidroside on oxidative stress injury of stem cells from human deciduous teeth （SHED） induced by hydrogen peroxide （H2O2）. Methods SHED were treated with H2O2 to build the oxidative stress cell model， and the cells were divided into control group， H2O2 group and each dose group of salidroside （including high dose， medium dose and low dose groups）. The cell morphology was observed under microscope after treatment with fluorescence staining. The malondialdehyde （MDA） content and superoxide dismutase （SOD） activity were determined by ELISA， and the expression of p38 and p-p38 proteins were detected using Western blot. Results Microscopically， the cells in H2O2 model group were obviously deformed and some cells were suspended in the culture solution. The cell deformation degree of salidroside low dose group was lighter than that of H2O2 model group， and the number of exfoliated suspended cells was less. The cell morphology in high dose group of salidroside tends to normal morphology， and shedding was rare. The MDA content in H2O2 model group and salidroside dose group were significantly higher than that in blank control group， and the MDA content in salidroside dose group was significantly lower than that in H2O2 model group， the differences were statistically significant （P<0.01）. The SOD activity of H2O2 model group and salidroside in each dose group were lower than those of blank control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in SOD activity between low dose salidroside group and H2O2 model group （P>0.05）. The SOD activity in high and medium dose groups of salidroside were higher than those in H2O2 model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The phosphorylation level of p38 protein in H2O2 model group and salidroside low dose group were higher than those in blank control group， the differences were statistically significant （P<0.01）. The phosphorylation level of p38 protein in salidroside high dose group was lower than that in H2O2 model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Salidroside protect against SHED oxidative stress injury induced by H2O2 partly through inhibiting p38 phosphorylation.

[Key words] Salidroside; Hydrogen peroxide; Stem cells from human exfoliated deciduous teeth; Oxidative stress

人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）是從脫落乳牙的牙髓中分離得到的一種具有高度增殖能力和多向分化能力的干細(xì)胞，其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力，因此頗受關(guān)注[1]。干細(xì)胞的增殖和分化能力受環(huán)境影響甚大，其中氧自由基可對(duì)牙髓干細(xì)胞的分化和自我更新潛力產(chǎn)生不良影響[2]，因此，考察氧化應(yīng)激對(duì)SHED的影響并尋找可行的干預(yù)措施具有重要意義。紅景天生長(zhǎng)于高山地區(qū)，具有益氣活血、通脈平喘之功效[3]，為臨床常用藥，紅景天苷為其主要活性成分之一[4]。據(jù)報(bào)道，紅景天苷具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗疲勞等藥理作用，對(duì)多系統(tǒng)細(xì)胞氧化及細(xì)胞衰老具有抵抗作用[5]。本實(shí)驗(yàn)以過氧化氫刺激SHED，構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型，研究紅景天苷對(duì)SHED氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為SHED的研究及應(yīng)用提供支持，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

紅景天苷購于中國(guó)食品藥品檢定研究院，加少量二甲亞砜溶解，再加培養(yǎng)基稀釋成1 mg/ml的溶液;SHED由深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院口腔研究所分離得到;最小必需培養(yǎng)基（MEM-α）、胎牛血清、雙抗和胰酶消化液均為Gibco產(chǎn)品;3% H2O2為廣東恒健制藥有限公司產(chǎn)品;蛋白定量試劑盒、熒光染色劑（C10045）均購于賽默飛世爾有限公司;磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.4）和細(xì)胞裂解液購于上海生工生物工程股份有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）（WST-1法）和細(xì)胞丙二醛（MDA）（微板法）的ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所;p38和p-p38抗體購于德國(guó)CST股份公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理? 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、H2O2模型組、紅景天苷低劑量組、中劑量組和高劑量組。細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%雙抗的MEM-α培養(yǎng)液、37℃、飽和濕度、5% CO2的條件下培養(yǎng)[6]，傳代兩次后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。空白對(duì)照組含正常細(xì)胞和基礎(chǔ)培養(yǎng)液，H2O2模型組在此基礎(chǔ)上加入H2O2（終濃度400 μmol/L，下同）進(jìn)行刺激，紅景天苷各劑量組細(xì)胞于接種4 h后，加紅景天苷（低、中、高劑量組終濃度分別為10、20和40 μg/ml）共培養(yǎng)，測(cè)定指標(biāo)前加入H2O2刺激2 h。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)觀察? 將SHED按1×104細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4 h后紅景天苷組加入不同劑量紅景天苷，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，H2O2模型組和紅景天苷組均加入H2O2刺激2 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，熒光染色劑染色，再加PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞行態(tài)，拍照。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞的SOD活性和MDA含量? 取生長(zhǎng)良好的SHED，以0.5×105細(xì)胞/ml密度接種于96孔板，每孔200 μl，按“1.2.1”項(xiàng)下方法分組和處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，按照試劑盒說明書，取培養(yǎng)上清液用于測(cè)定SOD活性。另將細(xì)胞接種于24孔板中，相同方法處理，最后棄去培養(yǎng)上清液，將細(xì)胞刮下，按照說明書方法，測(cè)定MDA含量。

1.2.4 免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)p38和p-p38蛋白的表達(dá)? 取生長(zhǎng)良好的SHED接種于6孔板中，按照“1.2.1”項(xiàng)下方法分組和處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，處理完成后棄去上層培養(yǎng)液，PBS洗凈細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，按蛋白濃度測(cè)定試劑盒方法測(cè)定蛋白濃度，Western blot檢測(cè)p38和p-p38蛋白的表達(dá)情況，并以p-p38/p38相對(duì)灰度值為指標(biāo)，比較不同分組p38蛋白磷酸化水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組SHED形態(tài)觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察經(jīng)不同方法處理的SHED，結(jié)果提示，空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)舒展，貼壁好;H2O2模型組細(xì)胞緊縮變形，部分細(xì)胞脫落懸浮于培養(yǎng)液中;紅景天苷低劑量組細(xì)胞變形程度輕于H2O2模型組，脫落懸浮細(xì)胞較少;紅景天苷高劑量組細(xì)胞形態(tài)更趨于正常狀態(tài)，脫落情況少見（圖1，見封三）。

2.2各組MDA含量和SOD活性測(cè)定結(jié)果的比較

ELISA測(cè)定結(jié)果提示，H2O2模型組、紅景天苷各劑量組的MDA含量均顯著高于空白對(duì)照組，且紅景天苷各劑量組的MDA含量均顯著低于H2O2模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖2）。

SOD活性測(cè)癥結(jié)果提示，H2O2模型組、紅景天苷各劑量組的SOD活性均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;紅景天苷低劑量組的SOD活性與H2O2模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;紅景天苷高、中劑量組的SOD活性均高于H2O2模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。

2.3相關(guān)蛋白表達(dá)情況測(cè)定結(jié)果

Western blot結(jié)果提示，H2O2模型組、紅景天苷低劑量組的p38蛋白磷酸化水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;紅景天苷高劑量組的p38蛋白磷酸化水平低于H2O2模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4、5）。

3討論

由于SHED具有高度增殖、多向分化能力和易獲得的特征，有學(xué)者認(rèn)為其是可以在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用的最佳干細(xì)胞[7]。目前SHED已被成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、牙本質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，SHED在不同部位缺損骨組織的修復(fù)中起到了出色的作用，展示了其在組織修復(fù)方面的應(yīng)用潛力[1]，頗受學(xué)者關(guān)注。

氧化應(yīng)激是由體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）而導(dǎo)致[8]，過量的活性自由基使體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，產(chǎn)生較大量氧化中間產(chǎn)物，從而對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生不良影響[9]。研究表明，氧化應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，干細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)過程中也伴隨著氧化應(yīng)激的影響[10-12]。那么，SHED生長(zhǎng)過程中是否也易受氧化應(yīng)激的影響？紅景天苷是否具有相應(yīng)的保護(hù)作用？為探討上述問題，首先需要建立氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究較常見的是H2O2氧化損傷模型。H2O2作為一種活性小分子，易于透過各種生物膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)生反應(yīng)并生成高活性的自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13-14]。關(guān)于H2O2的濃度和作用時(shí)間，針對(duì)不同細(xì)胞，文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也各不相同[15-16]。因此，本研究進(jìn)行了相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，用H2O2 100、200、400和500 μmol/L等不同濃度，分別刺激1、2、3、4和5 h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并最終選擇了400 μmol/L作用2 h。本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)還考察了紅景天苷對(duì)SHED存活率的影響，觀察其對(duì)細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果提示，紅景天苷在本研究所設(shè)定的濃度下，并未降低細(xì)胞存活率，表明其對(duì)SHED不具有明顯毒性。本研究通過對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果提示，紅景天苷對(duì)H2O2所致的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，ELISA測(cè)定結(jié)果提示紅景天苷抑制H2O2誘導(dǎo)的MDA升高和SOD下降，印證了這一作用。

參與氧化應(yīng)激的細(xì)胞通路較多，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是其中最重要的通路之一[17]，該通路在細(xì)胞増殖、分化、死亡等生命過程中有重要作用，已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18-19]。p38是MAPK家族的一個(gè)主要成員，其被定義為刺激應(yīng)答激酶，參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控[20]。有研究報(bào)道[21]，p38能被H2O2所激活，從而在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中起關(guān)鍵作用。因此，本研究通過觀察p38和p-p38的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)p38蛋白磷酸化表達(dá)，而紅景天苷對(duì)此具有抑制作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了氧化應(yīng)激對(duì)SHED的損傷作用，以及紅景天苷對(duì)該損傷的保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用與紅景天苷抑制H2O2誘導(dǎo)的p38磷酸化表達(dá)有關(guān)，但更進(jìn)一步的作用機(jī)制仍有待繼續(xù)研究。

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（收稿日期：2019-04-30? ?本文編輯：孟慶卿）