HPLC同時(shí)測(cè)定金羚感冒片中綠原酸、馬錢苷和蒙花苷的含量

薛劍橋，畢春艷，周 三

（1.青島大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物與生藥學(xué)系，山東 青島 266021；2.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博255086）

金羚感冒片是由水牛角濃縮粉、羚羊角、忍冬藤、野菊花、北豆根、阿司匹林、撲爾敏、維生素C八味藥組成，有辛涼解表，清熱解毒的作用，用于傷風(fēng)感冒及上呼吸道感染[1]。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)頒布時(shí)間較早，標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，只有方中用量最小的撲爾敏的鑒別，其他成分沒有質(zhì)控項(xiàng)目，無法較好地考察該品種的質(zhì)量。

方中投料量最大的為忍冬藤，忍冬藤具有清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)的功效。忍冬藤藥典規(guī)定的指標(biāo)成分為綠原酸和馬錢苷。忍冬藤可通過綠原酸作用在2條信號(hào)通路部分環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎作用[2]。綠原酸類化合物對(duì)多種病毒有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用[3-4]。方中臣藥為野菊花，能治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、頭痛眩暈等癥?，F(xiàn)代研究表明，野菊花含黃酮類、揮發(fā)油和萜類、多糖、有機(jī)酸類及微量元素等多種化學(xué)成分，它們是野菊花藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，而總黃酮和揮發(fā)油是野菊花的主要成分，近年的研究也逐漸受到關(guān)注[5]，野菊花中的黃酮類成分具有抗炎免疫、肝保護(hù)、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗菌等多種藥理作用[6-10]。野菊花藥典規(guī)定的指標(biāo)成分為黃酮類之一──蒙花苷。為了提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保臨床應(yīng)用的安全有效，本文采用高效液相色譜法（HPLC）法同時(shí)測(cè)定綠原酸、馬錢苷和蒙花苷3種成分的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），配備SPD-20A UV/VIS檢測(cè)器及LC-solution工作站；Mettler Toledo MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）；BWS-10恒溫水浴鍋（上海一恒公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-201314）；馬錢苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111640-201005）；蒙花苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111528-201710）；金羚感冒片3批（山東潤(rùn)華藥業(yè)，批號(hào)：03161203，03170301，150903）； 甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱為Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.6 %冰醋酸溶液，梯度洗脫：0～30 min，甲醇20 %～52 %， 30～60 min，甲醇48 %，柱溫為30 ℃；流速為1.0 ml/min。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000。相鄰兩峰的分離度應(yīng)不小于1.5。拖尾因子應(yīng)在0.95～1.05之間。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、馬錢苷、蒙花苷對(duì)照品各10 mg，分別置入50 ml量瓶，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。臨用時(shí)，精密吸取上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1 ml，置入同一5 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，密塞，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，稱定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制備工藝制備不含忍冬藤、野菊花外的其他藥味，按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制得陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液中，分別在與綠原酸、馬錢苷和蒙花苷對(duì)照品相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照品對(duì)測(cè)定無干擾，見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，4，8，10，20 μl，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（μg）對(duì)峰面積（A） 進(jìn)行線性回歸，得綠原酸回歸方程為Y=32330X-1761，r=0.9999；馬錢苷回歸方程為Y=84 922X+7344，r=0.9999；蒙花苷苷回歸方程為Y=13 274X+3835，r=0.9993，結(jié)果表明，綠原酸在0.0750～0.7496 μg、馬錢苷在0.0889～0.8888 μg、蒙花苷在0.0866～0.8664 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，按規(guī)定連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、蒙花苷峰面積的RSD分別為0.11 %，0.23 %，0.25 %（n=6）。表明儀器的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金羚感冒片（批號(hào)為03161203）樣品6份，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、蒙花苷平均含量分別為0.9329，2.3990，1.0644 mg/g，RSD分別為1.0 %，1.1 %，0.9 %（n=6）。表明用本方法測(cè)定綠原酸、馬錢苷、蒙花苷的含量重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批金羚感冒片（批號(hào)為03161203），按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、蒙花苷峰面積的RSD分別為0.1 %，0.2 %，0.2 %。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測(cè)定的需求。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 分別取同一批金羚感冒片（批號(hào)：03161203，綠原酸、馬錢苷、蒙花苷含量分別為0.9329，2.3990 ，1.0644 mg/g）樣品約0.25 g，精密稱定，共6份，分別精密加入綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 ml、馬錢苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液3 ml、蒙花苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 ml，50 %甲醇20 ml，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果綠原酸、馬錢苷、蒙花苷的平均回收率分別為102.1 %，103.3 %，102.4 %，RSD分別為0.9 %，1.2 %，1.1 %（n=6）。結(jié)果表明，本法的準(zhǔn)確度較好。

2.4 樣品測(cè)定

取3批金羚感冒片（批號(hào)分別為03161203，03170301，150903），分別按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算綠原酸、馬錢苷、蒙花苷的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 供試品中綠原酸、馬錢苷、蒙花苷含量測(cè)定（n=3）

3 討論

金羚感冒片原標(biāo)準(zhǔn)無含量測(cè)定項(xiàng)，不能有效評(píng)估其產(chǎn)品質(zhì)量，臨床效果也難以確認(rèn)。本文測(cè)定金羚感冒片中君臣藥味中的3種主要成分，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。流動(dòng)相的選擇參考多篇文獻(xiàn)，嘗試了不同的流動(dòng)相和不同比例[11-17]，發(fā)現(xiàn)分離效果均不理想，后嘗試梯度洗脫，最終確定用甲醇和0.6 %冰醋酸進(jìn)行梯度洗脫得到的峰形較好，分離度能達(dá)到要求。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇參考了藥典中忍冬藤和野菊花的檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm[17]和334 nm[17]，試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)334 nm處檢測(cè)不到馬錢苷峰，波長(zhǎng)226 nm處3個(gè)對(duì)照品峰形都很好，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇226 nm。

考察了50 %甲醇，75 %的甲醇，甲醇、50 %乙醇、75 %乙醇、乙醇的提取效果，結(jié)果顯示50 %甲醇優(yōu)于其他溶劑，故采用50 %甲醇提取。同時(shí)對(duì)溶劑用量及提取時(shí)間進(jìn)行了考察，最終確定以50 %甲醇加熱回流提取60 min作為制備供試品溶液的條件。